精宏电热水槽用于分辨熔解检测

材料与试剂

荧光定量 PCR 仪( MyGo Pro) ，IT-IS Life Science Ltd; 实时荧光定量 PCR 仪( Qtower 2． 2) ，德国耶拿公 司; 电热恒温水槽( DK-8D) ，上海精宏实验设备有限 公司; 高速冷冻离心机( 5424R) ，Eppendorf 有限公司; 超微量分光光度计( Q6000) ，美国 Quawell。新鲜牛乳样品采集于陕西省西安市未央区某奶 牛场，新鲜羊乳样品采集于未央区某市场农户处，样 品存于 － 20 ℃ 冰箱备用; 其他用于验证引物特异性 DNA( 鸡、猪、马、兔、鸭、狗和猫) 样本购买于四川华 汉三创有限公司; 其他不同类型全脂羊奶产品、低脂 羊奶产品、羊奶片等实际样品随机购买于大型商场。

实验方法

LAMP 扩增所用的酶最适反应温 度为 60 ～ 68 ℃，当反应温度降到 60 ℃ 以下时，聚合 酶的酶活力减弱，扩增效率降低，因此选择 60、61、 62、63、64 和 65 ℃ 6 个温度对反应体系进行优化。 改变奶牛和奶山羊的引物用量体积比例，即 0． 1 ∶ 0． 2、0． 15∶ 0． 2、0． 2∶ 0． 2、0． 1∶ 0． 3、0． 1∶ 0． 4，以挑选出 最适引物浓度比。取 7 ng /μL 的羊乳 DNA 为原液，分别掺入不同 体积比例的牛乳 DNA，体积比例依次为 100% 、80% 、 50% 、10% 、5% 、1% 、0． 1% 和 0% ，取 1． 2 μL 上述混 合 DNA 作为模板进行 LAMP 扩增，分析此方式的检测 限。在羊乳实际样品中混合不同体积比例的牛乳，混 合体积比例为 100%、50%、15%、5%、1%、0． 5% 和 0%，再进行 DNA 提取，确定此种混合方式的检测限。为了验证方法的可行性，本实验对奶牛、山羊及 两者混合 DNA 进行 LAMP 检测。尽管 LAMP 的扩增 产物是一系列大小不一的 DNA 片段混合物，但 Tm 值 相对稳定，这主要取决于靶序列长度和目标片段 GC 比例。

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