光敏胶束制剂的分布研究（精宏干燥箱使用）

肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，目前恶性肿 瘤的治疗方法主要有手术切除、化疗和放疗。化疗 作为一种主要手段，存在药物选择性低、不良反应 大、药物水溶性低的缺点，这其中也包括紫杉烷类 抗肿瘤药物———多西他赛，以上缺点限制了其在临 床中的应用。光敏胶束纳米制剂具有高药物负 载率、血液长循环及高通透性和滞留效应、良好的 可控性和可调节性，使药物能更安全有效地进入肿 瘤组织、提高治疗效果，而成为聚合物胶束纳米药 物载体研究的重点，光疗－化疗联合治疗比单纯 的化疗药 物 有 更 好 的 稳 定 性 和 更 高 的 治 疗 效 果。 但是，大多数光化学反应由紫外光源诱导产生，有 低穿透性、组织损伤的缺点，限制了它们作为刺激 源在药物释放领域的应用。

１ 材料

１．１ 仪器

Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ 高效液相色谱仪（美国 Ａｇｉｌｅｎｔ公司），ＡＲ１１４０ 型 电 子 天 平 （梅 特 勒－托 利 多仪器公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），Ｚ３６ＨＫ 高速冷冻离心机（德国贝托 特·哈默机械制造股份公司），Ｔ２５数显匀浆机（德国 ＩＫＡ 实验技术公司），ＱＬ－８６６旋涡混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），ＭＤ２００－２型氮气吹 扫仪（杭州奥盛仪器有限公司），ＴＤＬ－８０－２Ｂ 台式离 心机（上海安亭科学仪器厂，离心半径 １３．５ｃｍ）， 昆山舒美KQ-250型超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂）， Ｍｉｌｌｉ－Ｑ 超纯 水 系 统 （美 国 Ｍｉｌｆｏｒｄ 公 司），０～１５０ ｍｍ 数显游标卡尺（上海台海工量具有限公司），Ｅ－ ＣＬＩＰＳＥ８０ｉ型荧光显微镜（日本 Ｎｉｋｏｎ公司），ＹＤ－ ２５０８Ｂ 型转轮式切片机（浙江省金华市益迪医疗设 备厂），ＳＹＤ－ＰＫ 型漂片机、ＳＹＤ－Ｂ型组织石蜡包埋 机（沈阳誉得电子仪器有限公司）。

１．２ 试药

三氯甲烷（分析纯，天津市凯通化学试 剂有限公司，２００４１１０４），甲醇（色谱纯，天津四友精 细化学品有限公司，４０１３２１），０．９％氯化钠注射液 （浙江济民制药有限公司，０９０３２３８３），肝素钠（美国 Ｂｉｏｓｈａｒｐ公司），多西他赛（纯度＞９９％，北京怡禾生 物工程有限公司，ＦＰ２００９０３０１）。

１．３ 实验动物

ＫＭ 小鼠（１８～２０ｇ，雌雄各半，河 南省实 验 动 物 中 心，合 格 证 号：ＳＣＸＫ（豫）２０１１－ ０００１，许可证号：ＳＹＸＫ（豫）２０１１－０００１），鼠源腹水 瘤 细 胞 Ｓ１８０ 细 胞 株 （中 国 科 学 院 细 胞 库， ＨＹＣ３２０４）。

２ 实验方法

２．１ 细胞培养

取冻存的 Ｓ１８０细胞株，将其快速 复苏并注入健康小鼠腹部，每只注射０．２ｍＬ 细胞 悬液，培养鼠源Ｓ１８０细胞备用。

２．２ 荷瘤小鼠模型的构建

从小鼠腹部抽取 腹 水，用０．９％ ＮａＣｌ注射液将细胞悬液密度调整为２ ×１０６个／ｍＬ，按每只小鼠０．１ｍＬ的细胞悬液量接 种于 ＫＭ 小鼠右侧颈背部皮下。正常饲养并密切 观察 ＫＭ 小鼠的健康状况。接种后若有肿块样鼓 包形 成，则 说 明 造 瘤 成 功。肿 瘤 体 积 在 ６０～１００ ｍｍ３（一般情况下为接种后６ｄ左右），可作为动物 模型使用。用游标卡尺测量肿瘤直径，并记录小鼠 的体质量变化。根据以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积 Ｖ（ｍｍ３）＝１／２×ａ×ｂ２，其中ａ为肿瘤的长径， ｂ为肿瘤的短径。

２．３ 生物样品中药物含量测定方法的建立

２．３．１ 色 谱 条 件

色 谱 柱：ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱 （２５０ ｍｍ × ４．６ｍｍ，５μｍ）；预柱：ＧｕａｒｄＣｏｌｕｍｎＣ１８柱 （１０ｍｍ × ４．６ｍｍ，１０μｍ）；柱温：３０ ℃；流动相∶ 甲醇－水（７５∶２５）；流速：１ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长：２２９ ｎｍ；进样量：２０μＬ。

２．３．２ 样品的处理

血浆制备：（１）将每个时间点 的血浆样品置于放有肝素的１．５ｍＬ聚丙烯离心管 中，５０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，精密吸取上清液置 于１．５ｍＬ聚丙烯离心管中于－２０ ℃贮存，备用。 （２）器官匀浆液制备：取小鼠瘤，用０．９％ ＮａＣｌ 注射液洗涤去血，滤纸吸干水分，于－２０ ℃贮存备 用。精密称取各组织适量，加入３倍量的水，玻璃匀 浆器匀浆。 精密吸取０．２ｍＬ血浆或器官匀浆液，加入２ｍＬ 甲基叔丁基醚，涡旋混合３ｍｉｎ，于１２０００ｒ·ｍｉｎ－１离 心１０ｍｉｎ，取上层液并将其置于４０℃氮气下吹干，加 入０．２ｍＬ甲醇复溶后，在已知色谱条件下进样。 取空白血浆及组织样品２００μＬ 置于５ｍＬ 离 心管中，分别加入配制好的不同浓度的 ＤＴＸ 溶液 １０μＬ，涡 旋 混 合 均 匀，得 到 含 ＤＴＸ 质 量 浓 度 为 ０．１０１，０．２０２，０．５０５，１．０１，５．０５，１０．１，２０．２ μｇ·ｍＬ－１的血浆及肿瘤组织样品。加入２ｍＬ甲基 叔丁基醚，涡旋振荡２ｍｉｎ混匀，经４０００ｒ·ｍｉｎ－１ 离心１５ｍｉｎ，取上清，４０ ℃氮气吹干，加２００μＬ 流 动相 复 溶，涡 旋 振 荡 １ ｍｉｎ，１００００ｒ·ｍｉｎ－１ 离 心 ５ｍｉｎ，取上清进样。

２．３．３ 方法学考察

２．３．３．１ 专属性

精密吸取处理后的样品２０μＬ 进样，记录色谱图及 ＤＴＸ的峰面积，ＤＴＸ的保留时 间大约为６．２５ｍｉｎ，分离度较好，内源性物质并不 影响 ＤＴＸ的测定，见图１。

２．３．３．２ 标准曲线

精密量取空白血浆或肿瘤组 织匀浆０．５ｍＬ，分别加入１００μＬ不同浓度的 ＤＴＸ 储备液，配 制 成 有 不 同 浓 度 ＤＴＸ 的 生 物 样 品，按 “样品的处理”进行处理和测定，高效液相记录色谱 图及 ＤＴＸ 的峰面积，以 ＤＴＸ 的峰面积对 ＤＴＸ 的 浓度进行线性回归，血浆及肿瘤组织的标准曲线在 ０．１０１～２０．２０μｇ·ｍＬ－１范围内线性关系良好。

３ 结果

本文将疏 水 性 药 物 ＤＴＸ 制 成 磁 光 敏 胶 束 纳 米制剂 Ｃ６０／Ｆｅ３Ｏ４－ＵＣＮＰｓ＠ＤＴＸ＠ＳＮＳＣ，对 该 制 剂在 ＫＭ 荷瘤小鼠体内药动学和组织分布药效学 进行考察。Ｆｅ３Ｏ４的 磁 靶 向 特 性 可 将 纳 米 复 合 物 成功靶向到 肿 瘤 部 位，提 高 药 物 在 肿 瘤 部 位 的 聚 集，ＵＣＮＰｓ可为药物释放及活性氧的产生提供能 量。采用 ＨＰＬＣ法测定血浆和肿瘤组织内的 ＤＴＸ 血药浓度，其专属性、线性、回收率、精密度及稳定 性良好。


 

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