分析他克莫司微生物限度方法学

他 克 莫 司（tacrolimus）为 17- 烯丙基 -1，14- 二羟基 -12-［2-（4- 羟 -3- 甲氧基环己基）-1- 甲 基乙烯基］-23，25- 二甲氧基 -13，19，21，27- 四甲 基 -11，28- 二 噁 -4- 氮 杂 环［22.3.1.04，9］二 十 八 烷 -18- 烯 -2，3，10，16- 四 酮 一 水 合 物，结 构 式 见 图 1。相对分子质量 822.02，按 无 水 物 计 算，含 C44H69NO12（他克莫司与异构体I、异构体II之和）应为 98.0％ ~102.0%。

1　实验材料

1.1 样品　

他克莫司原料，国药川抗有限公司生产， 批号 160501、160502、160503。

验证实验所用的菌株传代次数 不得超过 5 代，并采用适宜的菌种传代、保藏技术， 以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌 CMCC （B）44102（第 三 代）、金 黄 色 葡 萄 球 菌 CMCC（B） 26003（第三代）、枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63501（第 三代）、铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104（第三代）、黑 曲霉 CMCC（F）98003（第三代）、白色念珠菌 CMCC （F）98001（第三代），均由四川省食品药品检测检验 院提供。

含 0.1% 吐温 80（成都市科 隆化学品有限公司，AR，500 mL·瓶 -1）的 pH 7.0 无 菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液（北京三药科技开发公司， 250 g·瓶 -1），无菌十四烷酸异丙酯（北京牛牛基因技 术有限公司，200 mL·瓶 -1），胰酪琼大豆胨脂培养基 （北京三药科技开发公司，250 g·瓶 -1），胰酪琼大豆胨 液体培养基（北京三药科技开发公司，250 g·瓶 -1）， 沙氏葡萄糖琼脂培养基（北京三药科技开发公司， 250 g·瓶 -1），麦康凯液体培养基（北京三药科技开 发公司，250 g·瓶 -1），麦康凯琼脂培养基（北京三药 科技开发公司，250 g·瓶 -1）。

SW-CJ-2FD 洁净工作台（苏州安 泰空气技术有限公司），ESCO-AC2-6S1 生物安全柜 （新加坡艺思高有限公司），LDZH-100KBS 压力蒸汽 灭菌器（上海精宏实验设备有限公司），LY05-300 恒 温恒湿培养箱（上海龙跃仪器设备有限公司，LY05- 300，MJP-150 霉菌培养箱（上海精宏实验设备有限 公司），HTY-2000 集菌仪（杭州泰林生物技术设备 有限公司）等。

接种铜绿假单胞菌、金黄色葡 萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌置 10 mL 胰酪大 豆胨液体培养基中，33 ℃培养 18~24 h。取上述新鲜培养液 1 mL，加 0.9% 无菌氯化钠溶液 9 mL，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5~10-8，制成含菌数约小于 100 cfu·mL-1 的菌悬液。

接种白色念珠菌至 10 mL 沙氏葡萄糖液体培养基中，25 ℃培养 24~48 h。取此 新鲜培养液 1 mL，加 0.9% 无菌氯化钠溶液 9 mL，采 用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5~10-7，制成含菌数约 为小于 100 cfu·mL-1 的菌悬液。 2.1.3　黑曲霉菌菌液　接种黑曲霉菌至沙氏葡萄 糖琼脂斜面培养基中，25 ℃培养 5~7 d，在新鲜培 养物中加入 3~5 mL 含 0.05% 聚山梨酯 80 的 0.9% 无 菌 氯 化 钠 溶 液，将 孢 子 洗 脱，取 1 mL 吸至无菌 试 管 内，加 含 0.05% 聚山梨酯 80 的 0.9% 无菌氯 化钠溶液 9 mL，采 用 10 倍 递 增 稀 释 法，稀 释 至 10-5~10-7，制成含菌数约小于 100 cfu·mL-1 的菌悬 液。

按上述方法，进行 3 次独立平行试验，并分别计 算各试验菌每次试验的回收试验比值。

回收试验比值=（试验组平均菌落数 - 供试品 对照组平均菌落数）/ 菌液对照组组平均菌落数

取 1∶10 的供试液② 10 mL，加 入 100 mL 含 0.1% 吐 温 80 的 pH 7.0 无菌氯化钠 - 蛋 白胨缓冲液，混匀，过滤，用 900 mL 含 0.1% 吐温 80 的 pH 7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液分次冲洗，每 次不超过 100 mL，在最后 1 次冲洗液中加入大肠埃 希菌菌悬液 1 mL（小于 100 cfu），取滤膜至 300 mL 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置 33 ℃培养 18~ 24 h。

本次对他克莫司微生物限度方法学验证过程中 发现，他克莫司原料对霉菌的抑菌作用最强，须将供 试品进行 1∶100 浓度稀释、萃取，并按最大冲洗量 对滤膜进行冲洗（《中华人民共和国药典》要求每张 滤膜每次冲洗量一般为 100 mL，总冲洗量不得超过 1 000 mL ）并使用了吐温 80 作为乳化剂；而对 需氧菌抑菌性作用没有对霉菌抑菌性作用强，实验过 程中发现按 1∶10 浓度稀释并冲洗 1 000 mL 冲洗液 能达到消除抑菌性的效果，但根据药典要求都采取了 相同的供试液制备方法及冲洗用量进行计数方法适 用性试验。验证过程中采用了单一的平皿法或培养 基稀释法进行适用性试验，也采用单一的薄膜过滤法 用不同的冲洗量进行适用性试验，未能达到回收比值 要求，只将最后试验成功的方法联用进行了体现。



 

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