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浅谈体外成像及抗肿瘤活性

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-09-06 09:16【

肿瘤是人类医学发展史上的巨大挑战,随着纳米技术的发展,纳米医药技术被认为在实现肿瘤的 高效和个性化治疗上具有极大的优势。但迄 今为止,纳米药物的临床转化仍然面临许多挑战, 包括纳米颗粒的生物相容性,临床结果与动物模型 实验的巨大差异和肿瘤的多药耐药性等。即使已 经进入临床阶段的纳米药物也被发现更多的是降 低药物不良反应而非增强治疗效果。由于人体 生理环境复杂,纳米药物的靶向递送低于预期设 计。研究人员指出通过被动靶向递送药物时, 纳米颗粒从血管渗漏的速度很慢,药物在积累达到 治疗水平所需浓度前排泄或代谢。因此,有必 要对纳米药物的体内行为进行监控,以便掌握药物 分布和疗效的实时信息,从而以受控和合理的方式 调整治疗策略,改善治疗效果。



1 材 料

1. 1 药品与试剂


大豆磷脂( Lipoid S 100,德国 Lipoid 公司) ; 胆 固醇( 日本东京化成工业株式会社) ; 十 八 胺 ( 90% ,麦克林化学试剂有限公司) ; 盐酸阿霉素 ( 99. 92% ,上海毕得医药科技有限公司) ; 香豆素6、DAPI、4% 多聚甲醛固定液( 源叶生物科技有限 公司) ; 其他试剂均国产分析纯。MDA-MB-231( 人 乳腺肿瘤细胞) 由江苏省肿瘤发生与干预实验室 提供。



1. 2 仪 器

SHZ-B( III) 循环多用真空泵( 南京科博尔仪器设备有限公司) ; 医用离心机( 湖南湘仪实验室仪 器开发有限公司) ; UV-3600 紫外分光光度计( 日 本岛津公司) ; ZS90 纳米粒径电位分析仪( 英国 Malvern 公司) ; THZ-320 台式恒温振荡器( 上海精宏实验设备有限公司) ; SCIENTZ-II D 超声波细胞 粉碎机( 宁波新芝生物科技股份有限公司) ; 低温 时间分辨荧光光谱仪( 英国爱丁 堡 仪 器 公 司) ; NIR-II 活体 成 像 系 统 ( 武汉光映美科技有限公司) ; 酶标仪( 美国伯腾仪器有限公司) ; 场发射扫描 电子显微镜( 德国 Zeiss 公司) ; 透射电子显微镜( 日 本电子株式会社) 。



2 方 法 和 结 果

根据文献合成 IR1061 后,用薄膜水化-超 声法制备 NIR-II 成像阳离子脂质体。精确称取卵 磷脂、吐温-80、十八胺、胆固醇和 IR1061 ( 质量比 120∶ 24∶ 12∶ 12∶ 1) ,用二氯甲烷/乙醇( 体积比 8∶ 1) 溶于圆 底 烧 瓶 内,37 ℃ 旋转蒸发成膜后,加 入 0. 9% NaCl 溶液 10 mL,37 ℃下振荡水化 3 h,水浴 超声 3 min,过 450 和 220 nm 滤 膜 各 两 次,得 IR1061 阳离子脂质体。制备载阿霉素 NIR-II 成像 阳离子脂质体,精确称取卵磷脂、吐温-80、十八胺、 胆固醇和 IR1061( 质量比 120∶ 24∶ 12∶ 12∶ 1) 按原方 案成膜后,根据硫酸铵梯度载药法加入 3% 硫酸铵 溶液水化,将所得脂质体于 0. 9% NaCl 溶液中透 析 48 h 后,按配方加入阿霉素( PC-DOX,8∶ 1) ,在 50 ℃ 下搅拌 30 min。将制得阿霉素脂质体置于 0. 9% NaCl 中透析 48 h,去除游离阿霉素。制备非 十八胺改性的 DOX-IR1061 脂质体( DOX-IR1061- Liposome) 作为对照组,其配方为卵磷脂、吐温-80、 胆固醇和 IR1061( 质量比 120∶ 24∶ 12∶ 1) ,制备方法 同 DOX-IR1061 阳离子脂质体。选择香豆素-6,一 种激光转化效率高,性能较稳定的脂溶性染料作为 荧光探针用于监测阳离子脂质体及普通脂质体的 细胞摄取行为。为了实现对脂质体的细胞摄取行 为的观测,用等物质的量香豆素-6 代替 IR1061 制备 DOX-Coumarin-6 阳离子脂质体及 DOX-Coumarin-6 脂质体。同时,DOX 的荧光性质使其可作为荧光药 物模型用于药物摄取分析。MDA-MB-231 在含盖玻片的培养皿中培养 24 h。观察细胞贴壁并生长至适宜密度后用 DOXCoumarin-6 阳离子脂质体和 DOX-Coumarin-6 脂质 体,分别处理细胞 1 和 2 h,并用 PBS 洗涤 3 次。然 后用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 min,再次使用 PBS 洗涤 3 次。加入 5 μg /mL DAPI 染液染色,避光放 置 5 min 后去除染色剂,加入抗荧光淬灭剂封片。 使用激光共聚焦显微镜观察玻片样品( 405 nm: DAPI,488 nm: 香豆素-6,555 nm: DOX) 。通过薄膜水化-超声法制备脂质体,测得 DOXIR1061 阳离子脂质体流体动力学尺寸为( 149. 9 ± 5. 3) nm,多分散系数为 0. 175,Zeta 电位为 + ( 25. 6 ± 0. 32) mV,DOX 包封率( 95. 8 ± 2. 4) % 。在 TEM 下观察如图 1-a 所示,脂质体结构清晰完整,并由 于硫酸铵与阿霉素形成结晶,观察到脂质体内部 明显的内核结构。以上数据显示 DOX-IR1061 阳 离子脂质体具有相对均匀的分布,并成功载入阿 霉素。



3 总结与展望

近红外二区荧光成像技术的优势使其具有巨 大的发展潜力,通过纳米技术将这一成像优势与化 疗功能结合有利于推动肿瘤的诊疗发展。本研究 成功构建了用于近红外二区荧光成像的 IR1061 脂 质体,对脂质体进行表征并通过体外成像实验验证 其近红外二区成像能力,并通过在脂质体水核载入 DOX 作为治疗剂,具备实现诊断与治疗联合的潜 力。另一方面,通过激光共聚焦实验验证所制备阳 离子脂质体引起细胞对 DOX 摄取增强,并进一步 通过细胞实验证明,十八胺与 DOX 联合起到增强 脂质体抗肿瘤能力的作用。






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