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糖蛋白协同替莫唑胺的胶质瘤治疗作用分析

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-09 09:37【

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤, 据报道,中国脑胶质瘤年发病率为 3~6 人/10 万人,年死亡人数达 3 万人。胶质瘤为浸润性生长, 和正常脑组织没有明显界限,难以完全切除,对放疗、化疗不甚敏感,非常容易复发,至今仍是全身 肿瘤中预后最差的肿瘤之一。将抗肿瘤药物与引经 药联合使用,增加治疗药物靶区的浓度,是提高脑 胶质瘤治疗效果的有效手段。

1 材料

1.1 药品及试剂

TMZ,批号 K19A9B58889,源叶生物科技有限 公司;VO,批号 20170614,其中总内酯质量分数 为 50.27%,藁本内酯质量分数为 30.67%,陕西昊 辰生物科技有限公司;聚山梨酯-80,Solarbio 公司; ECM 基础培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉 素双抗,Sciencell 公司;Ham’s F-12K 培养基、马 血清,美国 Hyclone 公司;FBS,美国 Gibco 公司; 胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、Hanks 缓冲液、 固体石蜡、树胶、磷酸盐缓冲液(PBS)、4×蛋白 上样缓冲液、0.22 μm PVDF 膜、1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8、1 mol/L Tris-HCl pH 6.8、10×电转液、5×Tris 甘氨酸电泳缓冲液、牛血清白蛋白(BSA)、20×TBS、 彩虹 245 plus 广谱蛋白 Marker,Solarbio 公司;P-gp 抗体(Abcam 公司);GAPDH 抗体、辣根酶标记山 羊抗小鼠 IgG、HRP 辣根酶标记山羊抗兔 IgG,北 京中杉金桥生物技术有限公司;化学发光剂、BCA 试剂盒,天根生化科技有限公司;二甲苯、无水乙 醇、甲醛均为西陇科学股份有限公司产品。

1.2 仪器

AE31 倒置生物显微镜,麦克奥迪实业集团有 限公司;01220 数显恒温水浴锅,常州国华电器有 限公司;SW-CJ-2FD 超净工作台,苏净集团苏州安 泰空气技术有限公司;Forma 3111 二氧化碳恒温培 养箱,Thermo Electron 公司;3-18K 离心机,德国 Sigma 公司;Agilent1260 高效液相色谱仪,美国 Agilent 公司;多功能酶标仪,Thermo 公司;冰箱, 青岛海尔股份有限公司;脑立体定向仪,德国 Kopf 公司;电动牙科钻,美国 Foredom 公司;微量注射泵,美国 KD Scientific 公司;RM2255 型包埋机、 EG1150H 型切片机、HI1210 型摊片机、HI1220 型 烘片机均为德国莱卡公司产品;BX43 型光学显微 镜,日本 Olympus 公司;A-35 型刀片,日本 Feather 公司;精宏DNP-9052 电热恒温培养箱,上海精宏实验 设备有限公司;GL-6250A 磁力搅拌器、TS-8 脱色 摇床,海门其林贝尔仪器制造有限公司;1645050 电泳电源、1658001 垂直电泳槽,BioRad 公司; Chemiscope 6000 Pro 荧光及化学发成像系统,上海 勤翔科学仪器有限公司。

1.3 细胞及动物

大鼠 C6 胶质瘤细胞,上海中乔新舟生物科技 有限公司;U87-MG 细胞,北京北纳创联生物技术 研究院;SPF 级雄性 Wistar 大鼠,体质量 220~240 g,南京君科生物科技有限公司,实验动物许可证号 SCXK(沪)2013-0016,由江西中医药大学实验动 物中心按 SPF 级动物标准饲养

2 方法

C6 细胞加入适量含有 15%马血清、2.5% FBS 的 Ham’s F-12K 培养液,置于 37 ℃、5% CO2 的培 养箱中培养。取对数期细胞,常温下经 0.25%胰酶 消化,吹打细胞制成细胞悬液,将细胞转置于离心管中,细胞计数板计数,用台盼蓝排斥实验确定细 胞存活率,需存活率>95%。离心管中剩余细胞以 1 000 r/min 离心 3 min,弃去上清液,调整细胞密度 为 7×107 个/mL 用于接种。U87-MG 细胞培养基为 含 10% FBS 的 DMEM,培养方法同 C6 细胞。大鼠接种 C6 细胞 2 周后,随机抽取 5 只,取 瘤区脑组织做病理切片,判断模型复制是否成功。 若镜下见梭形细胞呈浸润性生长,细胞异型性明显, 核分裂相易见,肿瘤微血管丰富,中心有明显的出 血及栅栏状坏死,表明造模成功。随机将制备成功 的模型大鼠分为模型组(给予双蒸水)、TMZ 组(25 mg/kg)、TMZ+VO 低剂量组(TMZ/VO 2.5,25 mg/kg+2.5 mg/kg)、TMZ+VO 高剂量组(TMZ/VO 5,25 mg/kg+5 mg/kg),每组 15 只,ig 给药,连 续给药 5 d,给药体积为 10 mL/kg。各组大鼠给药后 10%水合氯醛麻醉,仰卧位固 定,以横膈肌处为起点,将胸部皮毛、肌肉组织剪 开,切开纵膈肌,将两侧肋骨剪断,用止血钳夹住 前胸肋骨剑突向上翻起,以便暴露心脏,用镊子将 心脏固定,将灌注针从左心室插入主动脉弓起始部, 用止血钳固定心脏及针头,剪开右心耳,先用 300 mL 37 ℃生理盐水进行快速灌注,再用 200 mL 4% 多聚甲醛固定液 20 min 内匀速灌注。灌注完毕后, 开颅,将脑组织完整取出,在 4%多聚甲醛溶液内 固定 1 周。将肿瘤组织从脑内完整的剥离取出,称 质量,并测量肿瘤短径(a)和长径(b),计算肿瘤 体积(V)及肿瘤体积抑制率,肿瘤体积抑制率> 30%,表明肿瘤对药物敏感。

3 结果

造模前各组大鼠体质量无统计学 差异,造模后当天给予充足饲料,第 2 天观察大鼠 已开始自行觅食、饮水。术后大鼠食物和水的摄入 较术前均有减少。模型组大鼠术后出现精神状态萎 靡不振,毛发不整洁、黯淡无光,反应迟钝,活动 量减少,聚集成堆等表现,个别伴有腹泻等症状, 体质量下降明显;7~14 d 大鼠暴躁易怒,攻击力增 强,多数有明显的脑部肿起,部分出现眼眶周围出 血、鼻出血、偏瘫等颅内高压的症状。TMZ、TMZ/VO 2.5 和 TMZ/VO 5 组大鼠术后 14 d 内精神状态及颅 内高压症状表现与模型组相同,连续给药 5 d 后, 部分大鼠头部的肿起逐渐消失,毛发光泽度较模型 组光亮;14 d 后给药组大鼠体质量有缓慢上升的趋 势,TMZ/VO 2.5 和 TMZ/VO 5 组大鼠给药后体质 量比模型组及 TMZ 组大鼠上升更快,与模型组比 较差异显著(P<0.05)。

4 讨论

脑胶质瘤是最常见的颅内恶性原发性脑肿瘤,致死率高,由于其浸润性生长,和正常脑组织没有 明显界限,手术难完全切除,对放疗、化疗不甚敏 感,因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的 肿瘤之一。研究者利用肿瘤表面特异性高表达的受 体作为药物递送系统作用靶点构建一级靶向给 药系统,以及在一级靶向的基础上增加脑靶向的二级靶向。



 


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