雷帕霉素抑制肝纤维化分析（精宏DHG-9023A使用）

资料与方法

一、实验动物

健康雄性清洁级ＳＤ 大鼠８０只，鼠龄３～４个月， 体质量２３０～２７０ｇ，由西安交大医学院实验动物中心 提供，许可证号ＳＣＸＫ（陕）２０１２－００３。

二、主要仪器与试剂

主 要 仪 器 包 括 Ｋｅｎｄｒｏ 低 温 高 速 离 心 机 （德 国 Ｓｏｒｖａｌｌ公司）、ＤＹＮＥＸ ＭＲＸⅡ型酶标仪（日本 Ｄｙｎｅｘ 公司）、Ｏｌｙｍｐｕｓ光 学 显 微 镜（日 本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司）、 ＲＭ６２４０Ｂ多通道 生 理 信 号 采 集 处 理 系 统（成 都 仪 器 厂）、ＹＰ１００ 型 压 力 换 能 器 （成 都 仪 器 厂 ）、 ＳＨＨＷＺＩＣＹ４２０型电热恒温水浴箱（北京长安科学仪 器厂）、精宏DHG-9023A型 电 热 恒 温 鼓 风 干 燥 机（上 海 精 宏公司）、ＤＹＹ－８ 型 稳 压 稳 流 电 泳 仪 （上 海 琪 特）、 Ｋａｄｏｋ ＤＣｓ－１２０ 凝 胶 图 像 分 析 系 统 （美 国 Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）等。主要试剂包括雷帕霉素（华北 制 药 股 份 有 限 公 司，国 药 准 字 Ｈ２０１０００７９），Ｅ－ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 等 抗 体 均 购 自美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公 司，四 氯 化 碳 油 溶 液、组 织 细 胞 裂解液、ＥＣＬ 发 光 增 强 剂、兔 二 抗 工 作 液、ＤＡＢ 显 色 剂等均购自美国 ＰＩＥＲＣＥ公司。

三、实验方法

（一）纤维 化 动 物 模 型 制 作 及 用 药 取 健 康 雄 性 清洁级ＳＤ大鼠３２只，依据３ｍＬ／ｋｇ体质量皮下注射 四氯化碳油溶液４０ｍｌ／Ｌ，２次／周，持续８周，制备四 氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型。其中，雷帕霉素干预 组于第６周同时按２ｍｇ／ｋｇ体质量行雷帕霉素灌胃 处理，１次／ｄ，维持２周。另取１６只大鼠纳为正常组。 所有大鼠均于第８周处死。
（二）标本获 取 及 保 存 （１）肝 脏 组 织 标 本：既 定 时间 点 处 死 大 鼠，开 腹 后 于 腹 主 动 脉 取 血，完 整 切 离 肝脏，分别于各肝叶处取一块肝脏（厚约４ｍｍ），甲醛固定、常 规 脱 水、石 蜡 包 埋 处 理 后 将 剩 余 肝 脏 组 织 切 块，置入冻存管 中，于液氮条件下保存；（２）肝 细 胞 提 取：以原位加体外循环胶原酶灌注ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度离 心法，行大鼠肝细胞分离。大鼠腹腔打开后经门静脉 插管，注 入 肝 素 钠 抗 凝，５０ｍＬ 注 射 剂 缓 慢 灌 注 无 钙 Ｄ－ＨＡＮＫＳ液。冲洗肝脏，干净后０．０５％胶原酶液行 肝脏原位灌注，速度１０ｍＬ／ｍｉｎ，２ｍｉｎ后行肝上下腔 静脉 结 扎，将 肝 脏 取 出，行 胶 原 酶 液 灌 注 至 肝 组 织 变 软、苍白。肝脏抖动并钝性分离细胞，２００铂不锈钢筛 网过滤后洗涤，离心处理后获取肝细胞，置入冻存管， 于液氮罐冻存备用。
（三）肝脏组 织 ＨＥ 染 色 （１）肝 脏 组 织 切 片：切 片前将包埋好的标本置入－２０ ℃冰 箱 冷 冻３０ ｍｉｎ。 切片厚度３～５μｍ，于普通载玻片上粘附后于６０℃条 件下烘烤，６０ｍｉｎ后取出装盒；（２）ＨＥ染色：石蜡切片 脱蜡至水，经 ＰＢＳ冲 洗、苏 木 青 染 色、盐 酸 酒 精 分 化、 ＰＢＳ漂洗等处理后晾干后中性树胶封片，镜检。
（四）肝脏组 织 中 α－ＳＭＡ 表 达 检 测 （１）载 玻 片 及盖 玻 片 处 理、切 片：载 玻 片 洗 净 后 置 入 多 聚 赖 氨 酸 溶液（经１∶１０去离子水稀释）中，浸泡５ｍｉｎ后烘烤 装盒。切片于载玻片上粘附后烘烤装盒；（２）免 疫 组 化：石蜡切片脱 蜡 至 水，经 ＰＢＳ冲 洗、浸 泡、滴 加 二 抗 工作 液、苏木素复染等处理后中性树胶封 片，镜 检。 采用免疫组化检测肝组织中α－ＳＭＡ 表达。
（五）蛋白 表 达 检 测 将培养瓶中的细胞用细 胞 刷刮下后，经匀浆、Ｓ－ＰＡＧＥ胶制备、上样、电泳、转膜、 封闭、结合一抗、洗涤、曝光显影、定影 ＨＲＰ－ＥＣＬ发光 处理后，运用 Ｅｐｓｏｎ彩色图像扫描仪获取蛋白质信号 条带图像。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定蛋白表达。 四、观察指标 分析三组肝 脏 组 织α－ＳＭＡ 染 色、ＨＥ 染 色 结 果， 对比 三 组 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表 达，并观察三组上皮间质 转化通路重要蛋白 ｐ－ ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４表达，探讨雷帕霉素 抑制肝纤维化进程中肝细胞上皮间质转化机制。 五、统计学方法 采用ＳＰＳＳ１９．０ 软 件 处 理 数 据。以 百 分 率（％） 表示计数资料，组间行χ ２ 检验；以（ｘ珔±ｓ）表示计量资料，组间行ｔ值检验。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

结　　果

成功建立四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型，模型 对照组和雷帕霉素干预组在８周时各有１只死亡，均 经α－ＳＭＡ 组化、ＨＥ染色证实。经 ＨＥ染色发现雷帕 霉素干预 组 肝 纤 维 化 显 著 减 轻，经 免 疫 组 化 行 经 α－ ＳＭＡ 再次验证。模型对照组 肝 脏 中 肝 细 胞 内Ⅰ型胶原表达较正 常组明显增 高（Ｐ＜０．０５），上 皮 标 志 物 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、 ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表达较正常组明显减少（Ｐ＜０．０５），间 质细胞标志 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表达较正常组明显增高 （Ｐ＜０．０５），上皮间质转化通路重要蛋白 ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４ 较 正 常 组 明 显 增 高 （Ｐ ＜ ０．０５）。雷帕霉素干预组肝脏内肝细胞Ⅰ型胶原表达 及 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表 达 较 模 型 对 照 组 显 著 下 降（Ｐ ＜０．０５），肝细胞 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表达较模型 对 照 组 明 显 增 高 （Ｐ ＜０．０５），ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、 ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４表达较模型对照组显著下降 （Ｐ＜ ０．０５）。

讨　　论

近年来有研究表明，肝细胞上皮间质转化与肝纤 维化有关。Ｎｉｓｈｉｋａｗａ等采用 ＴＧＦ－β１处理体外 培养所致大鼠成熟肝细胞，发 现 肝 细 胞 经 ＴＧＦ－β１处 理后 白 蛋 白 表 达 明 显 下 降，Ⅰ 型 胶 原 表 达 上 升；而 ＴＧＦ－β１处理后尚存活肝细胞伴上皮间质转化，推 测 肝纤维化 中 肝 细 胞 上 皮 间 质 转 化 起 着 重 要 作 用。王 川林等发现，肝纤维化中纤维组织母细胞部分源于 成熟肝细 胞。四 氯 化 碳 诱 导 大 鼠 肝 纤 维 化 模 型 属 接 近肝炎肝纤维化模型。本研究经建立该模型发现，大 鼠肝纤维化过程中成熟肝细胞发生上皮间质转化，Ｅ－ ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表 达 明 显 减 少，间 质 细 胞 标 志 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表达明 显 增 高，且发现这类肝细胞 分泌Ⅰ型胶原增多，预示肝纤维化过程中肝细胞上皮 间质转化发挥着重要作用。本研究发现，肝细胞内上 皮间质转化通路重要蛋白ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／ ３、ｓｍａｄ４明显增高，进一步证实肝细胞上皮间质转化 参与肝纤维化过程。




 

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