中药知母抗真菌作用的影响(精宏DZF-6050使用)

知母为百合科植物知母 ( Anemarrhena asphodeloides Bge．) 的干燥根茎，具有清热泻火、滋阴 润燥的功效。知母皂苷是知母的主要有效成分， 含量 约 为 6%，包括呋甾皂苷如知母皂苷 B Ⅱ ( timosaponin BⅡ，TBⅡ) 、螺甾皂苷如知母皂苷 AⅢ ( timosaponin AⅢ，TAⅢ) 和知母皂苷元( sarsasapogenin， SAＲ) 等。

1 实验材料

1．1 菌株

ATCC 标 准 株: 白 念 珠 菌 ( Candida albicans) SC5314 和 Y0109、新型隐球菌( Cryptococcus neoformans) ATCC32609，由上海长征医院菌种保存 中 心 赠 送。临 床 株: 红 色 毛 癣 菌 ( Trichophytonrubrum) 、石膏样小孢子菌( Microsporum gypseum) 、 须癣毛癣菌( Trichophyton mentagrophytes) ，均由上海 长海医院真菌室提供，采自该院不同科室的临床样 本，并经形态学和生化学鉴定。

1．2 药物及试剂

知母饮片，上海康桥药业有限公 司( 批号: 170305) ; TBⅡ和 TAⅢ对照品，纯度＞98%，上海源叶生物科技有限公司; β-葡萄糖苷酶，上海宝 丰生化有限公司; 氟康唑注射液，辉瑞制药有限公司 ( 批号: B297805) ; 甲醇( 色谱纯) 、乙腈( 色谱纯) 、无 水乙醇( 分析纯) ，国药集团化学试剂有限公司。

1．3 主要仪器

高效液相色谱仪( Agilent 1100) 及 液相色谱系统( Agilent 1290，包括 G4220A 型二元输 液泵、G4226A 型自动进样器、G1316C 型柱温箱) ， 美国 Agilent 公 司; 蒸发光散射检测器 ( Alltech 3300) ，美 国 Grace 公 司; 酶 标 分 析 仪 ( Multiskan MK3) ，芬兰 Labsystems Dragon 公司; 超声波清洗器 ( KH-400KDB) ，巩义市予华仪器有限公司; 电子分 析天平( XS105) ，瑞士 Mettler Toledo 公司; 电热恒温 水浴锅( XMTD-8222) 、真空干燥箱( DZF-6050) ，上海精宏实验设备有限公司; 台式恒温振荡器( THZ82A) 、隔水式电热恒温培养箱( PYX-DHS-400-BS- Ⅱ) ，上海跃进医疗器械厂; 循环水式多用真空泵 ( SHB-ⅢA) ，郑州长城科工贸有限公司; 旋转蒸发 仪( ＲE-52AA) ，上海申生科技有限公司。

2 方法与结果

2．1 知母乙醇提取物制备

称取知母饮片 60 g，加 入 6 倍量 50%乙醇，加热回流提取 2 h，共 2 次。过 滤后合并提取液，减压旋转蒸发，回收乙醇，水浴蒸 干后转移至真空干燥箱，于 60 ℃ 减压干燥过夜，制 得知母乙醇提取物。

2．2 知母乙醇提取物酶水解物制备

称取知母乙 醇提取物和 β-葡萄糖苷酶各 4 g，置于带塞锥形瓶 内，加入 200 ml 醋酸－醋酸钠缓冲液，放入恒温振荡 器，50 ℃条件下振摇 2 h。采用等体积的水饱和正 丁醇萃取提取物 3 次，氨试液洗涤 3 次，合并正丁醇 萃取液，减压旋转蒸发，回收正丁醇，置于真空干燥 箱，60 ℃减压干燥，制得知母乙醇提取物酶水解物。

2．3 抗真菌作用比较

2．3．1 抑菌圈实验

吸取 5 μl 白念珠菌 SC5314 菌 液( 浓度为 1×104 CFU/ml) ，用无菌涂布棒均匀涂布 在培养基表面，每个培养基平板上间隔 20 mm 轻放 2 个无菌牛津杯，每个牛津杯中注入 150 μll 供试品药液( 知母乙醇提取物及其酶水解物) 。将培养基 平板置于生化培养箱内，于 30 ℃ 下培养 48 h，测量 抑菌圈直径。 结果显示，知母乙醇提取物在 320 mg /ml 时对 白念珠菌 SC5314 有一定的抑制作用，抑菌圈直径 为 6 mm; 其酶水解物在 27 mg /ml 和 13．5 mg /ml 时 对白念珠菌 SC5314 具有抑制作用，抑菌圈直径分 别为 16 mm 和 12 mm，抗真菌效果显著升高。

2．3．2 最小抑菌浓度( MIC) 测定

采用微量液基稀 释法检测知母乙醇提取物及其酶水解物对 5 种常见 致病真菌的 MIC，并以氟康唑为阳性对照药物。 将白念珠菌 SC5314 和 Y0109、新型隐球菌、红 色毛癣 菌、须 癣 毛 癣 菌、石膏样小孢子菌的菌液 100 μl( 浓度为 1 × 104 CFU/ml) 分别接种于 96 孔 板，加入不同浓度的受试药物或阳性对照药物，药 液终浓度分别为 64、32、16、8、4、2、1、0．5 mg /L，阴性 对照孔不添加任何药液干预。白念珠菌于 35 ℃ 静 置培养 24 h，新型隐球菌于 35 ℃ 静置培养 72 h，红 色毛癣菌、须癣毛癣菌、石膏样小孢子菌于 30 ℃ 培 养 7 d，酶标仪测量各孔在 630 nm 处的 OD 值。与 阴性对照孔相比，以 OD 值下降 80%以上的最低药 物浓度为 MIC80，即真菌生长 80%被抑制时的药物 浓度。若 MIC80值高于 64 mg /L，计为“＞64 mg /L”。 实验平行操作 3 次。当 MIC80值能准确重复或只差 一个浓度时可被接受，并以较高浓度作为 MIC80值; 当 MIC80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直 至符合要求。采用单因素方差分析对各组 MIC80值 进行 统 计 学 分 析，P＜0．05 表示差异具有统计学 意义。 结果显示，知母乙醇提取物的酶水解物对 5 种 真菌的 MIC80均达 4 mg /L，对石膏样小孢子菌和须 癣毛癣菌的抑制作用甚至优于氟康唑; 与知母乙醇 提取物 相 比，酶水解物的抗真菌活性显著增强 ( P＜0．01) 。TBⅡ对 5 种真菌的抑制作用均较弱，而 TAⅢ对丝状皮肤真菌红色毛癣菌、石膏样小孢子 菌、须癣毛癣菌的抑制作用较强，MIC80达 4 mg /L。 见表 1。


3 讨论

中药糖苷类成分在体内可代谢转化为活性更强的次生苷。本研究利用体外生物酶解技术模拟 知母药材有效成分的体内水解过程，并采用抑菌圈 实验和微量液基稀释法考察酶解技术对知母提取 物抗真菌活性的影响。体外研究发现，知母乙醇提 取物对 5 种真菌的抑菌效果均不理想，对白念珠菌、 新型隐球菌、须癣毛癣菌的 MIC80分别为 32 mg /L、 16 mg /L、32 mg /L，对石膏样小孢子菌和红色毛癣 菌无明显抑制作用; 经 β-葡萄糖苷酶作用后，酶水 解物 对 5 种常见致病真菌的 MIC80 均 降 低 至 4 mg /L。此外，酶水解物中的主要成分 TAⅢ( 含量 52．5%) 对须癣毛癣菌、红色毛癣菌、石膏样小孢子菌 的 MIC80均为 4 mg /L，而知母乙醇提取物中的主要成 分 TBⅡ对 5 种真菌的抑制活性均较弱。以上结果提 示在 β-葡萄糖苷酶的作用下，TBⅡ转化为抗真菌活性 更强的 TAⅢ，后者可能是酶水解物发挥抗真菌效应 的主要有效物质之一。临床上，红色毛癣菌在皮肤癣 菌中占比最高，可引发甲真菌病和足癣，而须癣毛癣 菌则是头癣的主要致病菌，本研究结果可能为知母治疗皮肤浅表真菌病提供参考和思路。

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