甲基海因含量的比较(精宏DHG-9123A使用)

哈蟆油( Oviductus Ｒanae) 系蛙科动物中国林蛙( Ｒana temporaria chensinensis David． ) 雌蛙的输卵管干制 品，纯天然、无污染、全营养，已然成为中国东北的珍贵滋补品。哈蟆油的食用历史可追溯到满族入关 之前，只有在满族大祀或大宴等重要活动时，哈蟆油才会作为最圣洁的食品出庖供盘。而在民间，哈蟆油有多 种加工方法，比如蒸、炖、烘干等，这些加工方法对哈蟆油中主要活性成分的影响尚不明确。因此，本文以 2015 版《中华人民共和国药典》一部中哈蟆油的鉴别指标———1 － 甲基海因为研究对象，通过 HPLC 法建 立含量测定方法，并对不同哈蟆油加工品中 1 － 甲基海因的含量进行比较，为哈蟆油加工方法的深入研究奠 定基础。

1 实验部分

1． 1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪、Chemstation 工作站( 美国安捷伦科技有限公司) ;昆山舒美KQ-250 型超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司) ; FA1004B 型电子天平( 上海佑科仪器仪表有限公司) ; AB135 － S 型电子分析天平 ( 梅特勒 － 托利多国际股份有限公司) ; 上海精宏DHG-9123A 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海精宏实验设备有限公司) 。 哈蟆油( 吉林省鼎源特产经贸有限公司，批号: 20170801) ，经由长春中医药大学中药鉴定教研室肖井雷 副教授鉴定为正品，符合《中华人民共和国药典》2015 版一部项下相关规定; 1 － 甲基海因( 中国药品生物制品 检定所，批号: 111836 － 201102) 。

1． 2 实验方法

1． 2． 1 哈蟆油加工品的加工方法

不同哈蟆油加工品的加工方法见表 1。

1． 2． 2 色谱条件

色谱柱为 AlltimaTM C18 柱( 4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相为纯净水，进样量为 10 μL，检测波长为 215 nm。

1． 2． 3 溶液配制

1． 2． 3． 1 对照品溶液

取 1 － 甲基海因对照品适量，精密称定，加甲醇制成 1 mL 含 0． 102 mg 的溶液，作为 1 － 甲基海因对照品 母液; 精密吸取 1 － 甲基海因对照品母液 1 mL，置 10 mL 量瓶中，制成 1mL 含 10． 2 μg 的溶液，即得。

1． 2． 3． 2 供试品溶液

取清炒、焦炒、水煮、清蒸、烘干及未加工的哈蟆油适量，粉碎，称取约 5 g，加入 8 倍量甲醇超声提取 30 min( 功率 250 W，频率 40 kHz) ，过滤，同法提取 3 次，收集、合并滤液; 旋转蒸发溶剂，转移至 5 mL 量瓶中， 加甲醇定容至刻度，即得。

2 实验结果

2． 1 系统适应性及专属性试验

分别取对照品溶液、清炒哈蟆油供试品溶液，按照上述色谱条件进行分析，结果如图 1 和图 2，待测色谱 峰与相邻色谱峰基本分离，理论塔板数按 1 － 甲基海因峰计算均不低于 3 000。

2． 2 线性关系试验

精密吸取上述配制好的 1 － 甲基海因对照品母液 0． 2、0． 4、1． 0、2． 0、4． 0 mL 分别置 10 mL 量瓶中，加甲 醇稀释定容到刻度，摇匀，使质量浓度分别为 2． 04、4． 08、10． 20、20． 40、40． 80、102 μg /mL。将 6 种溶液分别 注入高效液相色谱仪中，按照色谱条件进行测定。绘制标准曲线( 图 3) ，得回归方程 y = 42． 195x + 0． 087 3 ( Ｒ2 = 0． 999 6) ，结果表明，1 － 甲基海因质量浓度在 2． 04 ～ 102 μg /mL 范围线性关系良好。





3 讨论

3． 1 检测波长的选择

本文采用二极管阵列( DAD) 检测器进行全波长扫描，得到 1 － 甲基海因在 215 nm 有较大的吸收峰，且与 邻近色谱峰分离度较好，且基线平稳，故选择在该波长下进行检测。

3． 2 流动相体系的选择

预先选择了甲醇、甲醇 － 水、甲醇 － 0． 1% 磷酸、乙腈 － 水、乙腈 － 0． 1% 磷酸和水 6 种 流动相体系进行比较，考虑到待测色谱峰与相邻色谱峰的分离情况及峰形效果，故选择 100% 水作为流 动相进行洗脱。

3． 3 供试品制备方法的选择

本文分别比较了不同提取方法( 超声提取法、回流提取法和浸渍法) 、不同提取溶剂( 甲醇、无水乙醇、乙 酸乙酯、水) 和不同提取时间( 15 min、30 min、45 min、60 min) 对哈蟆油加工品中 1 － 甲基海因提取率的影响， 发现采用甲醇超声提取 30 min 时，1 － 甲基海因提取较完全，且不随着提取时间的延长而增加，故选择此条件 处理供试品。

3． 4 含量测定结果分析

本文通过对哈蟆油 5 种不同加工品中相关活性成分 1 － 甲基海因的含量进行测定。发现 100℃ 烘干 4 h 与未加工哈蟆油样品中 1 － 甲基海因的含量差别较小，水煮和清蒸的加工方法使 1 － 甲基海因的含量略有下 降，清炒和炒焦的加工方法使 1 － 甲基海因的含量明显地下降，且随着炒制时间的增加，1 － 甲基海因的含量 随之骤降，这些因素都可能影响哈蟆油的相关药效作用。

4 结论

本文建立的 HPLC 测定不同哈蟆油加工品中 1 － 甲基海因含量的方法操作简单、便捷、重复性良好。考虑到哈蟆油不同的加工方法还会影响到微生物活性、水溶性蛋白含量等方面，因此仍需对加工方法进行进一 步推敲，以确保达到哈蟆油药效的最佳发挥。



 

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