大鼠海马组织HIF-1α表达的影响分析

高原地区空气稀薄，大气氧含量低，可诱发心、 脑、肺等多脏器的缺氧损伤，大脑特别是海马组 织对缺氧最为敏感。随着人类在高原地区的生 活、工作及旅游的日益广泛，急性高原病、健忘、注意 力不集中、记忆力衰退等，越来越多地困扰着人们的 工作与生活，其严重程度与海拔高度、居住时间、海 拔上升速度以及个人体质等密切相关。

1 材料与方法

1. 1 实验动物

SPF 级雄性 Wistar 大鼠 144 只，体 重( 200 ± 20) g，购自中国人民解放军联勤保障部队 第九四〇医院动物实验科，实验动物许可证号: SYXK( 军) 2017-0046。饲养室温度为( 25 ± 2) ℃， 相对湿度为 40% ～ 60% 。所有大鼠标准饲料进行 喂养，自由进水。

1. 2 实验试剂与仪器

1. 2. 1 实验试剂

4% 多聚甲醛( Biosharp) ; BCA 蛋 白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、 4 × 蛋白质上样缓冲液( 含 DTT) 、脱脂奶粉、SDS、 Tris、Glycine、10 × TBST( 以上试剂均购自北京索莱 宝科技有限公司) ; ＲIPA 裂解液和 PMSF( 均购自碧 云天生物技术研究所) ; PageＲuler Prestained Protein Ladder ( Thermo Scientific ) ; Anti-HIF-1α 抗 体-ChIP Grade( Abcam) ; 小鼠 β-actin 单克隆抗体、辣根酶标 记山羊抗小鼠 lgG( H + L) 、辣根酶标记山羊抗兔 lgG( H + L) ( 以上均购自北京中杉金桥生物公司) ; 无水甲醇( 成都市科隆化学品有限公司) ; PVDF 膜( Immobilon-P Transfer Membranes) ; Carestream 医用 X 射线胶片( 厦门锐珂医疗器材公司) ; 通用显影粉 和酸性定影粉( 均购自天津市世纪奥博商贸公司) ; WesternBright ECL( A 液和 B 液) ( Advansta ( USA) 公司) 等。

1. 2. 2 实验仪器

E200 型光学显微镜( 日本 Nikon 公司) ; FLYDWC50-ⅡC 低压低氧动物实验舱( 贵州 风雷航空军械有限公司) ; Tissuelyser-24 多样品组织 研磨机( 上海净信实业发展有限公司) ; 3K15 型高 速冷冻离心机( Sigma 公司) ; SpectraMax  i3 型全 自动荧 光 酶 标 仪 ( 美 国 Molecular Devices 公 司) ; BP210S 型电子天平( 德国 Sartorius 公司) ; DK-8A 型电热恒温水槽( 上海精宏实验设备有限公司) ; ErpacTM Basic 基础电泳仪电源和小型垂直电泳槽、 Trans-Blot  TurboTM Transfer system 半 干 转 仪 ( BIO-ＲID) 等。

1. 3 实验方法

1. 3. 1 不同缺氧海拔暴露与分组

选取 72 只 SPF 级雄性 Wistar 大鼠随机分为常氧空白组 ( 海 拔 1500 m) 、缺 氧 3000 m、4500 m、6000 m、7500 m、 8000 m 组，每组 12 只，常氧空白组置于饲养室( 海 拔 1500 m，兰州) ，并将缺氧组大鼠按组别放入低压 低氧动物实验舱内，以10 m /s的速度分别将舱内海 拔升高到 3000 m、4500 m、6000 m、7500 m、8000 m， 缺氧暴露时间设置为 12 h。缺氧结束后，迅速解剖 取材，检测相关指标，固定缺氧暴露损伤最严重的海 拔高度。

1. 3. 2 不同缺氧时间暴露与分组

当缺氧暴露海拔 确定后，另取 72 只 SPF 级雄性 Wistar 大鼠随机分为 常氧空白组( 0 h) 、缺氧 6 h、12 h、24 h、36 h、72 h 组，每组 12 只。将缺氧组大鼠按组别放入低压低氧 动物实验舱内，以 10 m /s 的速度将舱内海拔升高到 上一组实验确定的海拔，缺氧暴露时间分别设置为 6 h、12 h、24 h、36 h、72 h。缺氧暴露后立即解剖取 材检测相关指标，确定缺氧暴露损伤最严重的时间。

1. 3. 3 海马组织样本采集

不同条件缺氧暴露后立 即将大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛麻醉，断头处死， 然后各组随机抽取大鼠 2 只剖取大脑，放入 4% 多 聚甲醛中进行固定，用以制备组织切片。剩余大鼠 剖取海马组织，按组别分装标记后于 － 80℃ 冰箱中 存放备用。

1. 3. 4 海马组织切片的制备

经过固定的大鼠大脑 组织标本，进行石蜡包埋后，6 μm 切片，裱于经多聚赖氨酸包埋的清洁载玻片上，常规进行脱蜡、复水、 磷酸盐缓冲液( PBS) 洗涤及苏木精 － 伊红( HE) 染 色，观察海马组织的病理形态。

1. 3. 5 海 马 组 织 中 HIF-1α 的 蛋 白 表 达

采 用 Western Blotting 法检测。称取海马组织约 50 mg，加 入 500 μl 的 ＲIPA 裂解液( 含 1% PMSF) 提取总蛋 白，并采用 BCA 法测定蛋白浓度。所制备的蛋白样 品于 － 80℃ 冰箱中存放。取样品 20 ～ 50 μg 进行 SDS-PAGE 电 泳。浓 缩 胶 浓 度 为 5% ，80 V 电 泳 40 min，分离胶浓度为 10% ，110 V 电泳 80 min，半 干法转膜，电转条件根据目的蛋白分子量不同而进 行设置，β-actin 为 18 V，15 min; HIF-1α 为 20 V， 15 min。转膜完毕，5% 脱脂奶粉封闭 2 h 后，以 4℃ 摇床孵育一抗过夜，一抗浓度分别为 β-actin ( 1 ∶ 1000) 、HIF-1α( 1∶ 1000) 。第 2 天，采用 1 × TBST 洗膜( 共 6 次，每次 8 min) 后，室温摇床孵育二抗， 二抗浓度为辣根酶标记山羊抗兔或抗小鼠 lgG( 1∶ 5000) 2 h，再次洗膜，ECL 显影曝光。

1. 4 统计学方法

应用统计软件 SPSS 24． 0 处理 数据; Image-Pro Plus 6． 0 软件对曝光图片进行灰度 扫描测定并进行结果分析。计量数据以均数 ± 标准 差( x ± s) 表示，进行正态性检验，符合正态分布的两 组间均数比较采用独立样本 t 检验。α = 0． 05 为检 验水准。

2 结果

常氧空白组大鼠海马组织呈正常 形态结构，细胞排列整齐、完整，神经元轮廓清晰，多 呈圆形，细胞核大而圆，着色较浅，位于细胞中央，细 胞核和细胞质边界清晰易辨。缺氧组大鼠海马组织 水肿、疏松; 神经元呈不同程度的变性、坏死，以及大 量周围神经空泡; 并且随着缺氧海拔增高和缺氧时 间延长，海马组织损伤愈严重。7500 m 海拔缺氧暴露对大鼠 海马组织中 HIF-1α 表达的影响最明显。故固定缺 氧 7500 m 不同缺氧时间暴露后发现，各 缺 氧 组 HIF-1α 的表达与常氧空白组相比有显著性差异 ( P ＜ 0. 01) 。随着缺氧时间延长，缺氧 6 h 至 24 h 时 HIF-1α 表达呈升高趋势，缺氧 ＞ 24 h 后 HIF-1α 表达可达到平台期。

3 讨论

本实验采用低压低氧动物实验舱模拟高原环境，研究不同高原缺氧暴露条件对大鼠海马组织病 理学及 HIF-1α 的影响; 结果显示，常氧空白组大鼠 海马组织结构完整，细胞排列整齐，但是随着缺氧海 拔升高及缺氧时间延长，海马组织结构疏松、水肿， 神经元呈不同程度的变性、坏死。HIF-1α 蛋白表达 在 3000 m 组缺氧 12 h 后与常氧空白组比较差异无 统计学意义; 但在海拔 4500 m、6000 m、7500 m 缺氧 环境下 HIF-1α 蛋白表达逐步升高，并有显著性差 异，进一步升高到 8000 m 时则有所下降。另一方 面，7500 m缺氧环境下，随着缺氧暴露时间的延长， HIF-1α蛋白表达呈升高趋势，缺氧 24 h、36 h、72 h 时，HIF-1α 蛋白表达水平可达到平台期。说明随着 缺氧海拔高度的升高，缺氧暴露时间的延长，7500 m 缺氧大于 24 h，HIF-1α 蛋白表达达到最大值，机体 缺氧损伤最严重。



 

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