上海精宏鼓风干燥箱对于黄酮工艺优化的使用

目前，工业化动物养殖为人们提供了大量廉价动 物蛋白，与此同时也造成了严重的环境污染问题，抗生 素通过食物链进入人体造成人体抗生素残留问题以及 耐药菌产生等问题。因此，寻找一系列安全、高效且价 格低廉的能够在工业化动物养殖中替代抗生素的药物 就显得越来越重要。黄酮类化合物是一类广泛存在于 种子、根、茎、叶等植物组织中的生物活性小分子化合 物，有很强的药理作用且毒副作用小。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 香椿子

香椿子采自铜仁市万山区谢桥街道石竹村， 60 ℃ 烘箱干燥2 h，粉碎后过60目筛，阴凉干燥处密 闭保存待用。

1.1.2 主要试剂

芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，含有量大 于98%)。无水乙醇、甲醇、石油醚、三氯化铝、醋酸钠、冰 醋酸、盐酸、氢氧化钠为市售分析纯；果胶酶(5×104 U/g) 购自南宁庞博生物工程有限公司；水为超纯水。

1.1.3 主要仪器

TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普 析通用仪器有限公司)；New human power Ⅰ纯水仪(韩 国Human公司)；CPA225D 型电子天平[赛多利斯科学 仪器(北京)有限公司]；CP153型电子天平[奥豪斯仪器 （上海）有限公司]；SB5200D型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；雷磁PHS-25型pH计（上海 仪电科学仪器股份有限公司）；TDZ4-WS型台式低速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；上海精宏DHG-9123A鼓风干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称取芦丁对照品 10 mg，置于 50 ml 容量瓶 中，以50%甲醇溶解，定容，充分振荡混匀得0.2 mg/ml 芦丁标准溶液。用移液管分别精密移取 0.50、1.00、 2.00、3.00、4.00、5.00 ml芦丁标准溶液于50 ml容量瓶 中，分别加入 2 ml 0.5 mol/l AlCl3溶液，摇匀，静置 15 min，用pH值为5.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液定容， 摇匀后超声震荡5 min，得6个浓度的芦丁测定液。 取其中一个浓度的芦丁测定液在TU-1901型双 光束紫外可见分光光度计上进行光谱扫描，确定最大 吸收波长。于最大吸收波长处依次测定6个浓度的芦 丁测定液的吸光度，用浓度校正法绘制芦丁标准曲线。

1.2.2 香椿子总黄酮提取及含量测定

100 g粉碎过筛后的香椿子粉末置于1 000 ml平底 烧瓶中，加入500 ml石油醚回流提取1 h，提取两次，合 并滤液后减压浓缩得香椿子油脂。滤渣于通风橱中挥 干石油醚后60 ℃烘干，阴凉干燥处密闭保存备用。 精密称取石油醚脱脂后的香椿子粉末 0.2 g，置 于20 ml具塞玻璃管中，加入提取液（N ml），在设定条 件下进行酶解提取。提取结束后用相应的乙醇溶液 补足失重后将滤液转移至10 ml离心管中4 000 r/min 离心10 min，上清液用移液器转移到离心管中备用。移取1 ml滤液，加入2 ml 0.5 mol/l AlCl3溶液，摇匀， 静置15 min，用pH值为5.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液 定容至 10 ml，摇匀后超声震荡 5 min，在 416 nm 处 测定吸光度，根据标准曲线计算该溶液中总黄酮浓度 C(mg/ml)。最终计算香椿子总黄酮含有量，公式为：总 黄酮含量=(C×N×10)/0.2（mg/g）。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 酶解pH值

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g，分 别置20 ml具塞玻璃管中，编号后加入含果胶酶（果胶酶 浓度为每100 ml乙醇溶液0.5 g果胶酶）的 75% 乙醇溶 液10 ml，用HCl和NaOH将pH值分别调至2.5、3.5、4.5、 5.5、6.5，在50 ℃下超声提取20 min。按1.2.2节方法处 理样品并测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

1.2.3.2 酶解温度

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g， 分别置20 ml具塞玻璃管中，编号后加入含果胶酶（果 胶酶浓度为每100 ml乙醇溶液0.5 g果胶酶）的 75% 乙醇溶液10 ml，pH值调至3.5，分别在35、40、45、50 、 55 ℃下超声提取20 min。按1.2.2节方法处理样品并 测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

1.2.3.3 酶解时间

精密称取5份石油醚脱脂后的香椿子粉末0.2 g， 分别置20 ml具塞玻璃管中，编号后加入含果胶酶（果 胶酶浓度为每100 ml乙醇溶液0.5 g果胶酶）的 75% 乙醇溶液10 ml，pH值调至3.5，在50 ℃下分别超声提 取10、20、30、40、50 min。按1.2.2节方法处理样品并 测定吸光度，计算香椿子总黄酮的含量。

2 结果与分析

黄酮类化合物经 AlCl3显色后，与铝离子形成稳 定的络合物，苯甲酰基部分引起的吸收带(300~ 400 nm)红移，吸光度明显增大且专属性提高。芦丁 经 AlCl3显色后，其 365 nm 处吸收峰红移至 416 nm， 且吸光度有所增加，见图1。

在最大吸收波长416 nm处，按照1.2.1节方法绘 制芦丁标准曲线，为 C=31.7A- 1.05，R=0.999 9，在 2.0~20.0 μg/ml范围内线性关系良好。酶只有在特定的pH值、温度下才能达到最大的 活性，果胶酶的作用 pH 值为 2.5~6.0，作用温度为 15~55 ℃。在香椿子总黄酮的酶解提取试验中，最佳 酶解 pH 值为 3.5，最佳作用温度为 50 ℃。后续试验中，为达到最佳的提取效果，我们将pH 值调至3.5，温度控制在50 ℃。酶的加 入，使植物中的细胞壁被破坏，其中果胶等高分子化 合物被分解为小分子物质，有效减小黄酮等小分子化 合物的溶出阻力，以达到提高总黄酮的提取率的效 果。因此酶的用量对总黄酮的提取率的影响非常关 键。随着酶用量的增大，香椿子总黄酮提取率逐渐升高，当用量达到1.00% 时，香椿子 总黄酮提取率出现峰值，随后随着酶用量的增大总黄 酮提取率略有下降，可能原因是当酶过量时，香椿子 粉末将会被大量的酶包裹，导致提取不彻底。所以我 们选用酶用量为0.75%、1.00%、1.25%进行正交试验。

3 讨论与结果

近年来，酶解法在提高植物有效成分的提取率方 面的研究、应用越来越多。其主要原因是酶能使 植物体内大分子化合物如果胶、纤维素、淀粉、蛋白质 等分解为小分子，从而减小其对植物体内生物小分子 化合物的束缚力，进而提高植物有效成分的提取率。 不同的植物、植物部位以及不同的目标化合物所需要 的酶是不同的，本实验考察了果胶酶、纤维素酶及果 胶酶与纤维素酶的复合酶对香椿子总黄酮提取率的影响，发现果胶酶能使香椿子总黄酮的提取率达到最 大，所以我们选择果胶酶对香椿子进行酶解。



 

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