精宏培养振荡器对葡萄酿酒酵母的分离的使用

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又称面包酵 母、出芽酵母，是与人类关系最广泛的一种酵母，也是 发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母在麦芽汁琼脂培 养基上菌落为乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐，无性繁 殖以芽殖为主。在生理特性方面，能发酵葡萄糖、麦芽 糖、半乳糖和蔗糖，不能发酵蜜二糖。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

从吉林市昌邑区左家镇中国农业科学院特产研究 所野生山葡萄园（ZJ）、吉林市昌邑区左家镇农大红山葡萄园（NDH）、通化市柳河县青木原山葡萄基地 （LH），分别采集成熟的山葡萄样本和山葡萄园土壤样 本各 3 份，样本总计 18 份，装入无菌袋中常温保存，立 即进行实验室菌种分离鉴定。

1.2 仪器与试剂

恒温培养震荡器（ZDP-250，上海精宏实验设备有限公司）；微生物培养箱（DHP，上海一恒科学仪器有限 公司）；生物安全柜（Thermo 1300 Series A2）、PCR 仪 （Veriti）〔赛默飞世尔科技（中国）有限公司〕；台式冷 冻离心机（5415R，德国艾本德股份公司）；凝胶电泳 仪（Bio-Rad PowerPac HC）、紫外凝胶成像仪（BioRad Gel Doc TM XR+）（美国伯乐生命医学产品有限 公司）。 麦芽汁培养基（青岛海博生物技术有限公司）； 酵母粉、蛋白胨（英国 Oxoid 公司）；酵母基因组 DNA 提取试剂盒、LA-Taq DNA 聚合酶、DNA Make〔r 宝生物工程（大连）有限公司〕；其他试剂均为国 产分析纯。

2 方法

2.1 菌种的筛选

麦芽汁固体培养基：麦芽汁培养基 131 g、琼脂粉 20 g，加蒸馏水至 1 L，121 ℃灭菌 30 min，然后倒入平 板，冷却后 4℃保存备用。YPD 液体培养基：2%葡萄 糖、2%蛋白胨、1%酵母粉，121℃灭菌 30 min，冷却后 4 ℃保存备用。 称取每份山葡萄样本 10 g，置于无菌研钵中研磨， 将山葡萄汁转入 100 mL 灭菌蒸馏水的三角烧瓶中充 分振荡 15 min；称取采集的土壤样本每份 1 g，加入至 9 mL 的灭菌蒸馏水中，充分振荡 10 min，静置 5 min。 分别 10 倍梯度稀释山葡萄汁水溶液和土壤水溶液至 10 4、10 5，取稀释液 100 L 涂布麦芽汁固体培养基 平板，28 ℃倒置培养 3 d，观察菌落生长情况。

2.2 菌株的分离优化

挑取麦芽汁琼脂培养基中生长情况良好的单菌 落，转移至含有 50 mL YPD 培养基的三角烧瓶中，12 层纱布封口，30 ℃、180 r/min振荡培养 36 h，测定细菌 生长浓度 OD600 值。

2.3 菌株理化性质鉴定

糖发酵实验对分离的菌株进行理化性质鉴定。

2.4 酵母基因组的提取

取 1~2×10 8 酵母菌的过夜培养液至 1.5mL 的 Microtube 中，12 000 r/min 离心 1 min。弃去上清，加 入 500 L 的 GenTLE Yeast Solution A，轻微振荡重悬 沉淀，37℃温浴 1 h，期间轻轻振荡离心管数次。加入 100 LGenTLE Yeast Solution B，轻微振荡混匀，70 ℃ 温浴 10 min。加入 200 LGenTLE Yeast Solution C， 轻微振荡混匀，冰浴 5 min，12 000 r/min 4 ℃离心 5 min。取上清于新的离心管中，加入 1/2 体积的异 丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，12 000 r/min 4℃离 心 5min，弃上清。加入 500 L 预冷的 70%乙醇，轻 轻颠倒洗涤沉淀，12 000 r/min 4 ℃离心 5 min，弃上 清。室温下干燥，加入适量的 TE Buffer 溶解， 20℃ 保存备用。

3 结果 

在采集的各土壤和山葡萄样本中均有圆润、白色、 整齐、形态较好的单菌落生长。挑取其中生长良好的单菌落共计 27 个菌落，转入 YPD 液体培养基中进行菌株分离优化，测定 24 h 和 36 h 的生长速度，以 OD600 计算。其中， 编号为 ZJ-02、ZJ-06、NDH-01、NDH-05、NDH-09、 LH-03、LH-05、LH-06 和 LH-08 共 9 株菌生长情况较 差，后续研究将这 9 株菌舍弃。分离的 18 株酵母菌 26S rRNA D1/D2 区基因序 列经过 PCR 克隆和测序后，在 NCBI GeneBank 数据 库中进行序列比对，依据分离株与标准株亲缘关系，构 建系统发育树，并对分离株进行分类。

4 结论

山葡萄作为酿酒原料已经有70多年的历史， 酵母是酿酒工艺中最关键的因素之一。本研究 选择的样本采集地点位于吉林省内山葡萄优质产区和 种植资源基地，种质优良、资源丰富。从采集的土壤和 山葡萄样本中经过菌株的分离优化、生理生化试验和 分子生物学鉴定，成功分离出 18 株酵母菌，其中有酿 酒酵母 12 株、发酵毕赤酵母 3 株、乳酸克鲁维酵母 3 株；从样本分布区域来看，分离出的酿酒酵母大多数为 自然生长酵母菌，占本次分离结果的 66.7%。为酿酒 酵母菌株选育、饲料酿酒酵母产品、有机矿物元素酵母 铁酵母铜饲料添加剂产品的研究提供了充足的菌种资源。



 

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