胡萝卜素消费菌的审定及其发酵工艺优化

β-胡萝卜素是类胡萝卜素的典型代表，主要有全反式、 9-顺式、13-顺式及15-顺式4种形式。大量研究表明，β-胡萝 卜素能转化为维生素A，具有抗氧化、预防癌症、预防心血 管疾病、提高免疫系统等功能。β-胡萝卜素的主要来源 有天然物提取法、化学合成法、微生物发酵法。天然物提取 法受产品原料、气候、运输条件的制约，成本高，产量较低； 化学合成法存在一定的危害。与其他方法相比，微生物发 酵法易培养，产量高，产品具有顺式和反式混合体，更加 安全，因此得到广泛的应用。

菌株S3-1：本实验室前期从土壤中分离、纯化并保藏。

酵母浸粉、蛋白胨、麦芽糖（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；玉米浆：上海方畦仪器有限公 司；β-胡萝卜素（纯度≥95%）：德国Sigma公司；Ezup柱式 真菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽 提试剂盒：上海生工生物工程股份有限公司；其他化学试 剂均为国产分析纯。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基： 青岛海博生物技术有限公司。 活化培养基：含0.1 g/L氯霉素的PDA培养基，pH自然， 121 ℃灭菌20 min。 种子培养基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖 20 g/L，pH自然，115 ℃灭菌30 min。 基础发酵培养基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋 白胨20 g/L、无水氯化钙0.5 g/L、磷酸二氢钾0.8 g/L，pH自 然，115 ℃灭菌30 min。

FA2004W电子分析天平：上海菁海仪器有限公司； EL20-K pH计：美国梅特勒托利多公司；LDZX-75KBS立式 高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；SHZ-2A数显气浴 恒温振荡器：金坛华峰仪器有限公司；SHP-250生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；TDZ7-WS离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；1260高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国安捷伦 科技有限公司。

按照Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株 S3-1的基因组，以其为模板，采用真菌核糖体ITS基因片段 的通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增。 PCR扩增体系：模板基因组0.5 μL，10×Buffer（含20 mmol/L Mg2+ ）0.5 μL，2.5mmol/L 脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.2 μL， 上下游引物（10 μmol/L）各取0.5 μL，双蒸水（ddH2O）补至 25 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s， 55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共循环30次；72 ℃再延伸 10 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测 后，送生工生物工程（上海）有限公司进行测序。将测序结 果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中进行 Blast比对，选取同源性较高的模式菌株的ITS基因序列，采 用MEGA7.0软件中的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系 统发育树，自展值为1 000。

菌株活化：将菌株S3-1划线于活化培养基，28 ℃倒置 培养3 d。种子培养：挑取活化培养基上的单菌落接种于装 液量为50 mL/250 mL的种子培养基中，28 ℃、150 r/min条 件下培养至对数期。发酵培养：按6%（V/V）的接种量将种 子液接种于装液量为40 mL/250 mL的基础发酵培养基中， 28 ℃、150 r/min条件下培养84 h。参考杨文等的方法，采 用酸热法进行破壁，丙酮进行提取，提取至菌体变白，合并 提取液，提取过程尽量避光。 在基础发酵培养基的基础上，分别考察碳源种类（葡 萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油） 及添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、氮 源种类（酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母浸粉+蛋白胨）及 添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、硫酸 镁添加量（0、0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L）、初始 pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）对菌体生长和β-胡萝卜素产量 的影响。根据β-胡萝卜素的产量和纯度筛选影响显著的因 子和最佳水平，进行4因素3水平正交试验，正交试验因素 与水平见表1。

2 结果与分析

菌株S3-1的PCR扩增产物的电泳图谱见图1。由图1可 知，PCR扩增产物碱基长度约为574 bp，与目的基因碱基长度相符，进行测序。

将菌株S3-1的ITS测序结果提交至NCBI的GenBank数 据库中进行Blast比对，选取同源性较高的模式菌株的ITS 基因序列，构建系统发育树，菌株 S3-1与近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）JQ2-1 聚于一支，亲缘关系最近，因此，鉴定菌株S3-1为近玫色锁 掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。韩梅等研究发现， S. pararoseus所产的β-胡萝卜素以全反式结构为主，全反式 结构约占总β-胡萝卜素的60%，顺式结构主要有13-顺和9- 顺β-胡萝卜素。不同微生物对碳源的需求不同，不同碳源对发酵产物 的合成可能产生不同的作用。因此，比较8种不同碳源对菌 株S3-1产β-胡萝卜素的影响，结果见表2。由表2可知，当以 蔗糖为碳源时，生物量最高，为（13.21±0.08）g/L，与葡萄糖、果糖、可溶性淀粉无显著差异（P＞0.05），但显著高于乳 糖、麦芽糖、甘油（P＜0.05）；当以葡萄糖为碳源时，β-胡萝 卜素产量及纯度最大（P＜0.05），分别为（1.95±0.26）mg/L、 （53.91±1.47）%。因此，选择葡萄糖作为最优碳源。

本研究以土壤中筛选出的一株高产高纯度β-胡萝卜 素的菌株S3-1为研究对象，采用分子生物学技术鉴定其为 近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。通过正交 试验优化确定菌株S3-1产β-胡萝卜素的最优发酵工艺： 葡萄糖40 g/L、酵母浸粉30 g/L、硫酸镁0.2 g/L、无水氯化 钙0.5 g/L、磷酸二氢钾0.8 g/L、初始pH值5.0。在最优发酵 工艺条件下，β-胡萝卜素产量为（3.08±0.46）mg/L，纯度为 （60.01±2.66）%。