精宏生化培养箱对K-7所产抑菌的稳定性研究

放线菌(Actinomycetales)是一类介于细菌与 丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生 物,因气生菌丝呈放射状而得名,放线菌目可分为 10个亚类,其代表菌属主要有链霉菌属(Strepto- mycetes)､小单孢菌属(Micromonospora)､诺卡氏 菌属(Nocardia)､马 杜 拉 放 线 菌 属 (Actinomadu- ra)､游动放线菌属(Actinoplanes),其中以链霉菌属为主。放线菌能产生丰富的、活性多样的次 级代谢产物，人类的生产、生活有着极为密切的关 系，其天然代谢产物一直是现代医药业、农业和畜 牧业中药物先导化合物的一个重要来源，如阿维 菌素、链霉素、宁南霉素、多抗霉素等，在农业生产 中有很重要的地位，同时应用代谢产物防治植物 病害，可减少农药的用量，维系生态平衡，确保农 业可持续发展。 生防 菌 弗 氏 链 霉 菌 Ｋ－７为 金 正 大 微 生 物 实 验室前期从临沭黄瓜大棚中筛选得到，其发酵液 上清对黄瓜枯萎病菌、香蕉枯萎病菌等多种病原 菌都有很强的抑制作用，为进一步研究其抑菌物 质的成分及能否在功能性肥料中添加使用，本研究通过对 Ｋ－７发酵液上清经过高温和高盐分处 理，看发酵液上清中抑菌物质对温度和盐分的耐 受性，为后期纯化、成分分析及在农业生产中使用 提供依据。

生防菌弗氏链霉菌 Ｋ－７为金正 大微生物实验室保存，前期研究表明在其发酵液 上清中含有抑菌物质。

黄 瓜 立 枯 病 菌（ｃｕｃｕｍｂｅｒ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）、香 蕉 枯 萎 病 菌 （Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｂｅｎｓｅ），所用供试病原菌菌 株 均由本实验室保存。

ＰＤＡ 液 体 培 养 基：马 铃 薯２００ ｇ，葡 萄 糖２０ｇ，蒸 馏 水１０００ｍＬ。ＰＤＡ 固 体 培 养基：马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂１５ｇ，蒸馏 水１０００ｍＬ。

亚磷酸二氢钾，分析纯，由金正大 生态集团股份有限公司提供；实验所用其它化学 试剂均为分析纯或按国家标准（ＧＢ）规定要求。

分析天平(德国赛多利斯)、 智微立式灭菌锅、无菌操作工作台、生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、 知楚摇床、打孔器、玻璃器皿等。

取 ４ ℃冰 箱 中 ＰＤＡ 斜 面 保 存 的 Ｋ－７ 菌 株 在 固 体 ＰＤＡ 平板上划线 活 化，放 于２８ ℃生 化 培 养 箱 培 养４ｄ。然后在超净工作台中用直径９ｍｍ 的打 孔器打菌片，挑 取４片 放 入 装 有２００ｍＬ 培 养 基 的１Ｌ三角瓶中，放入２８ ℃恒温摇床培养６０ｈ。 培养完成后８０００ｒ·ｍｉｎ－１，离心２０ｍｉｎ，上清即为 弗氏链霉菌 Ｋ－７发酵液上清。

含 药平板的制备：配制 ＰＤＡ 培养基，定量分装于三 角瓶内灭菌，待培养基冷却至５０℃左右时加入相 应的发酵液上清，制成含有不同浓度抑菌物质的 培养基，摇匀后倒入培养皿内冷凝备用。 发酵液抑菌效果测定：将各指示菌株 接 种 至ＰＤＡ 平板上，２８ ℃培养４８ｈ，用直径为９ｍｍ 打 孔器打取菌落边缘菌块作为接种物。将菌块随机 转接到含有不同浓度抑菌物质的培养皿中央，以 不加发酵液上清的培养基作空白对照，每一处理 重复 ３ 次，置于２８ ℃下培养２ｄ ，利用十字交叉 法测量菌落直径按照下面求出发酵液对供试菌的 抑制率。 抑制率（％）＝（对照菌落直径－处理菌落直 径）／对照菌落直径×１００

取灭菌 的１０ｍＬ离心管数只，每只装入５ｍＬ 弗氏链霉 菌 Ｋ－７发酵液上清，分别放到２５，６０，８０ ℃（分别 标记为 Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）恒 温 烘 箱，处 理 时 间 为４ｈ。 处理完成后按１．２．２的活性测定方法测定高温处 理后的上清 液 中 抑 菌 物 质 的 活 性，纯 ＰＤＡ 培 养 基（ＣＫ）作为对照。

取发酵液上清加入一定量的亚磷酸二氢钾配成 母液，充分溶解后室温放置４８ｈ后按１．２．２的方 法测定上 清 液 抑 菌 成 分 对 黄 瓜 立 枯 病 菌 抑 菌 活 性，等浓度的亚磷酸二氢钾溶液和未加盐处理的 上清液作为对照。试验处理分别为 Ｔ１：１００ｇ·Ｌ－１ 的亚磷酸二氢钾；Ｔ２：１００ｇ·Ｌ－１的亚磷酸 二 氢 钾 和发酵液上清复配；Ｔ３：发酵液上清，配置带毒平 板时按１０、２０、５０和１００倍稀释加入。

采 用 Ｅｘｃｅｌ２０１３ 和 ＳＰＳＳ １８．０进 行 数 据 处 理，采 用 Ｄｕｎｃａｎ′ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅｔｅｓｔ中 的 方 差 分 析 （ＡＮＯＶＡ）方 法 进 行 分析。

由表１可知，不同温度处理的弗氏链霉菌 Ｋ－ ７发酵液上清对黄瓜立枯病菌、香 蕉 枯 萎 病 菌 均 有不同程度的抑制作用，比较 Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３三个温 度处理后对立枯病菌和枯萎病菌的抑制率均无显 著差异，抑制率没有明显变化，说明发酵液上清经 ６０和８０ ℃处理后，其中的抑菌物质活性没有明 显变化，说明其抑菌物质对８０ ℃高温较为稳定。

２．２ 亚磷酸二氢钾对放线菌代谢产物的影响

由表２可知，不同处理的弗氏链霉菌 Ｋ－７发 酵液上清对黄瓜立枯病菌均有不同程度的抑制作 用，比较同一 稀 释 梯 度 抑 制 率，可 以 看 出 Ｋ－７发 酵液上清和高浓度亚磷酸二氢钾复配（Ｔ２）后，对 丝核菌的抑制效果显著优于单独上清液（Ｔ３），二 者显著优于单独的亚磷酸二氢钾（Ｔ１）处理，说明 发酵液上清中的抑菌物质对高浓度亚磷酸二氢钾 较为稳定。

３ 结论与讨论

通过 对 生 防 菌 弗 氏 链 霉 菌 Ｋ－７所 产 抑 菌 物 质的稳 定 性 研 究 发 现，Ｋ－７ 所 产 抑 菌 物 质 能 在 ８０ ℃下放置４ｈ其抑菌活性没有显著下降，说明 对温度较为稳定，因为在后期提纯过程会经过高 温灭活、喷雾干燥等过程，Ｋ－７所产抑菌物质对高 温较为稳定，有助于后期进行提纯并对其化学结构、理化性质进行进一步的研究。 弗氏 链 霉 菌 Ｋ－７发 酵 液 上 清 和 亚 磷 酸 二 氢 钾复配成１００ｇ·Ｌ－１的盐溶液放置４８ｈ后，复配液 对黄瓜立枯病菌的抑制率优于单独的 Ｋ－７发 酵 液上清，优于单独的亚磷酸二氢钾溶液，说明 Ｋ－７ 所产抑菌物质对高浓度亚磷酸二氢钾较为稳定。 有研究认为，亚磷酸盐能干扰和抑制病菌菌丝生 长及产孢，直接保护寄主，同时亚磷酸盐施用后被 叶片、根部吸收，运送至植株体内，等植物病菌入 侵时，刺激植株产生植物防御素。Ｋ－７所产抑 菌物质对高浓度亚磷酸二氢钾较为稳定，同时能 加强亚磷酸盐对立枯病菌、枯萎病菌等植物病害 的抑制作用，可以复配成农药或者肥料，在农业生 产中应用。 植物病害是严重威胁农业生产的自然生物灾 害之一，植物的健康和人的生活和健康息息相关。 常年化学农药的防治，导致防治效果下降，同时污 染了环境，也影响着人们的身体健康；放线菌种类 繁多，代谢功能各异，能产生大量的，种类繁多的 抗生素，在农业生产上起重要作用，如用阿维菌素 防 治 根 结 线 虫，用井冈霉素防治水 稻纹枯 病，用宁南霉素防治烟草花叶病毒病都取得了 极好的效果，同 时 又 绿 色 环 保，不 会 污 染 环 境 和影响人类健康。