使用光照培养箱白定点突变对甜菜夜蛾和棉铃虫

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins, Vips)是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringi⁃ ensis, Bt)营养生长期分泌的一种杀虫蛋白｡最早由 Estruch等(1996)从苏云金芽胞杆菌AB88菌株离心 的上清液中发现｡Vip3A 蛋白对鳞翅目昆虫具有 广谱的杀虫活性,与任何已知的杀虫晶体蛋白均没 有同源性;随着害虫对杀虫晶体蛋白抗性的产生, Vip 蛋白成为一个极为丰富且潜力巨大的资源 (Beard et al., 2008; Ramasamy et al., 2008; Yu et al., 2012)。

关于Vip蛋白结构与功能的研究,迄今主要集 中在Vip3Aa (Song et al., 2016)｡但是,与目前研究 比较深入的杀虫晶体蛋白相比,关于 Vip3 蛋白的 结构､功能及作用模式等方面的报道较少,并且未 得出一致的结论(Chakroun et al., 2016)｡部分研究 表明,丝氨酸突变对Vip3Aa杀虫活性影响较大,例 如,Vip3Aa11氨基端的第9位丝氨酸突变为天冬酰 胺(S9N)､第193位丝氨酸突变为苏氨酸(S193T)后, 对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉铃虫(Heliothis armigera)的杀虫活性有明显提高(Liu et al., 2017)｡ Dong 等(2012)将 Vip3Aa7 中的半胱氨酸突变为丝 氨酸,获得的突变体(C292S, C507S, C401S)对小菜 蛾(Plutella xylostella)杀虫活性明显降低,甚至丧失 活性｡Chi等(2017)将Vip3Aa的543位丝氨酸突变 为天冬酰胺(S543N)､686 位丝氨酸突变为精氨酸 (S686R),获得的突变体对甜菜夜蛾杀虫活性分别 提高5倍和8.98倍。

虽然前人已经对Vip3Aa11的结构与功能关系 进行了一些探索,但要完全阐明 Vip3Aa11 的杀虫 机理尚需更广泛的研究｡本课题组比对Vip3Aa11 与Vip3Aa39氨基酸序列的差异,选定3个位于活性 中心区､可能参与丝氨酸突变的位点进行定点突变，利用甜菜夜蛾和棉铃虫进行杀虫活性测定，并 进行胰蛋白酶敏感性及二级结构预测分析，旨在探 寻影响杀虫活性的氨基酸位点及其杀虫活性变化 原因，为杀虫机制研究提供基础材料。

定点突变所用的质粒pET-vip3Aa11､大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21(DE3)和 JM109 菌株均由东 北农业大学生物化学与分子生物学实验室保存｡ 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 和 DpnⅠ (DMT)酶购自 TransGen Biotech (北京);质粒提取 试剂盒､DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen (美国); PageRuler Prestained Protein Ladder 购 自 Thermo Scientific (美国);Gel Red 核酸染料购自 BIOTIUM (美国)。

根据 vip3Aa11 基因(GenBank No. AAR36859) 全长序列,通过 DNAMan 7.0 设计定点突变引物, 引物设计包含5'端重叠区和3'端延伸区;除突变位 点外,引物长度大约25~30 bp,5'端重叠区包含15~ 20 bp,3'端延伸区包含至少10 bp｡突变位点位于2 条引物上,分别位于正向突变引物重叠区下游､紧 邻重叠区和反向突变引物 5'端｡引物由上海生工 生物工程技术服务有限公司合成。

以转化 E. coli JM109 菌株的 pET-vip3Aa11 质 粒为模板,分别以G200S-F/R､F442S-F/R和S726TF/R为引物(表1),PCR扩增含突变位点的vip3Aa11 基因全长片段｡PCR反应体系均为:质粒1 μL,正反向突变引物(10 μmol/L)各 1 μL,2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL,加 ddH2O 至 50 μL｡ PCR 反应条件均为:94 ℃预变性 2 min;94 ℃变性 20 s,55 ℃退火 20 s,72 ℃延伸 3 min,23 个循环; 72 ℃延伸10 min｡ 为有效筛选突变克隆,需利用DMT酶体外降 解非突变型质粒模板｡因此,将1 μL DMT酶加入 50 μL PCR产物中,混合均匀,于37 ℃孵育1 h｡取 5 μL酶消化产物转化E.coli BL21,挑取单克隆并送 至吉林省库美生物科技有限公司进行序列测定分 析,以验证预期突变位点的碱基变化是否正确。

挑取1.3中含预期突变位点的E. coli单菌落于 5 mL 液体 LB 培养基,于 37 ℃､220 r/min 活化过 夜｡以 1% 接种量接种于 50 mL LB 液体培养基, 于 37 ℃､220 r/min 培养 2~2.5 h,直至 OD600 约为 0.5｡加入终浓度为 1 mmol/L 的异丙基-β-D-硫 代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG), 于 150 r/min､16 ℃诱导 12 h;于 4 ℃､8 000 r/min 离心 8 min,收集菌体沉淀 ;以 5 mL 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)悬浮;经超声波破碎(参数设置: 功率 70%; 超声 3 s, 间隙 1 s, 全程 3 min),于 4 ℃､ 12 000 r/min离心15 min,收集上清液。

取 Vip3Aa11 及其突变体蛋白样品加入 5×上 样缓冲液,混匀并煮沸 8 min,于 12 000 r/min 离心 1 min,取 5 μL 上清液进行 SDS-PAGE,电压为 120V,分离胶浓度为10%｡然后以考马斯亮蓝R250进 行凝胶染色｡对于凝胶上的蛋白条带,使用软件 QuantityOne 4.5进行定量分析:选取3个已知浓度 的标准牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 为蛋白定量标准,选取凝胶空白区为背景(background),选取 Vip3Aa11 及其突变体中 88 kD 的目 的条带,经软件处理得到目的蛋白浓度。

在室内杀虫活性测定中,称取30 g人工饲料置 于培养皿中,分别与3 mL不同浓度的Vip3Aa11及 其突变体蛋白样品混合,均匀分装于24孔板中;其 中,甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的杀虫活性测定设 置 80､40､20､10､1､0.1 μg/mL 等 6 个浓度,棉铃虫 (Heliothis armigera)的杀虫活性测定设置 200､100､ 50､25､5､1 μg/mL等6个浓度｡选取健康的､未经 取食的初孵幼虫(孵化后12 h内, 购自河南省济源 白云实业有限公司)作供试虫,用软毛笔轻移入已 有感染饲料的小孔内;每孔1头虫,每个处理重复3 次｡以转化pET28a质粒空载体的菌体总蛋白作为 阴性对照,以未发生突变的 Vip3Aa11 野生型蛋白 作为阳性对照｡在每个小孔上方铺上湿润卫生纸 后盖上塑料盖,以橡皮筋捆紧,竖立放入30 ℃ (棉 铃虫)或25 ℃ (甜菜夜蛾)光照培养箱（上海精宏实验设备有限公司提供）;培养7 d后调 查 活 虫 数 ,并 观 察 幼 虫 生 长 情 况 ,使 用 POLO (1987)软件计算致死中浓度(median lethal concentration, LC50)｡以野生型Vip3Aa11的LC50与其他杀 虫蛋白LC50的比值作为相对毒力。

1.7 胰蛋白酶敏感性分析

按照1.4步骤提取Vip3AA11及其突变体蛋白， 以 PBS 溶液(pH 8.0)代替 20 mmol/L Tris-HCl。将 蛋白样品与1 mg/mL胰蛋白酶按照10∶1的比例混 合均匀，于37 ℃水浴中分别放置2和32 min，加入 5×蛋白上样缓冲液终止反应，然后进行SDS-PAGE 分析。

以pET-vip3Aa11质粒为模板,利用含突变位点 的引物进行 PCR 扩增｡PCR 产物经 DMT 酶消化 后,取5 μL转化E. coli BL21感受态细胞,获得的单 克隆菌落用vip3AF/R引物对进行PCR鉴定｡结果 显 示 ,Vip3Aa11 及 其 3 个 突 变 体 G200S､F442S､ S726T均能扩增出预期的2 370 bp目的条带(图1), 说明阳性单克隆菌落中含有vip3Aa11 基因或突变 基因｡对于每个定点突变样品，选取2个经PCR鉴定 正确的单克隆进行测序。对测序结果进行序列分 析，均实现预期的点突变。

苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3Aa对多 种鳞翅目害虫具有较好的杀虫活性,并且被证实与 目前应用较多的杀虫晶体蛋白无交互抗性,具有广 阔的应用前景｡Vip3Aa 类蛋白是被发现､研究报 道 最 多 的 一 类 Vip 蛋 白 ,并 且 Vip3Aa19 与 Vip3Aa20 已经成功的应用于转基因作物中(Yu et al., 1997; Yu et al., 2001)。