使用生化培养箱对苦木提取物的体外抗菌活性和

苦 木 为 苦 木 科 木 本 植 物 苦 木 Picrasmaquas- sioides(D.Don)Benn.的干燥枝和叶,具有清热解毒 和燥湿杀虫的功效｡苦木含有以生物碱类成分为 主的化学成分,临床主治感冒､咽喉肿痛和腹泻下痢 等症｡国内外植物化学及药理学研究主要集中在 脂溶性 生 物 碱 类 成 分 的 抗 炎､抗肿瘤和降压等方 面,且对抗炎作用的研究多为口服或注射给药｡本 文对苦木水煎液和脂溶性总生物碱在体外对金黄色葡 萄球菌､铜绿假单胞菌､大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门 菌的最小抑菌 质 量 浓 度(MIC)和最小杀菌质量浓度 (MBC)进行了测定,对苦木水煎液外用抗炎作用进行 研究,为扩大该药的临床应用和研究提供参考。

Mettler-ToledoXS105DU 分 析 天 平(瑞士梅特勒-托利多公司);SartoriusBT25S型精密 分析天 平 (赛多利斯科学仪器有限公司);KQ-300 TDB高频数控超声波清洗 器(昆山市超声仪器有限 公司);SX-500 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅 (日 本 托 弥 公 司); 1300A2生物安全柜(美国 Thermo公司);生化培养 箱 (上海精宏实验设备有限公司);Leitz 1512型旋转 式 切 片 机 (德 国 Leitz 公司);DP-71型 显微镜 (日本 Olympus公司)。

苦木水煎液 (质 量 浓 度 为1g·mL-1, 自制);脂溶性总生物碱 (质量浓度为20mg·mL-1,自 制);盐酸小檗碱(质量浓度为2mg·mL-1,质量分数 >99.00%,批号1170713-201212),购自 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院;丁 酸 氢 化 可 的 松 乳 膏 (批 号 16080313,规格10g∶10mg),天津金耀药业有限公 司;小鼠免疫球 蛋 白 E(IgE)试剂盒及白细胞介素-6 (IL-6)试剂盒(北京雅安达生物技术有限公司);胰酪 大豆胨液体培养基(TSB)(批号20180116)和胰酪大 豆胨琼脂 培 养 基(TSA)(批号20180214),北京 奥 博 星生 物 技 术 有 限 责 任 公 司;生 理 盐 水 (批 号L218012411),四川科伦药业股份有限公司;2,4-二硝 基 氟 苯 (DNFB,批 号 BCBR8143V,质 量 分 数 ≥ 99%),Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司;丙酮(分 析纯,质量分数>99.5%),成都科龙化工试剂厂;橄 榄油(批号2018082201),成都市科隆化学品有限公 司。

金黄色葡萄球菌[菌株编号:CMCC(B) 26003]､铜绿假单胞菌[菌株编号:CMCC(B)10104]､ 大肠埃希菌[菌株编号:CMCC(B)44102]､乙型副伤 寒沙门菌[菌株编号:CMCC(B)50094],均购自中国 食品药品检定研究院｡ 1.4 动物 SPF 级昆明种小鼠32只,体质量25~ 30g,由西安交通大学实验 动 物 中 心 提 供,动 物 合 格 证号:SCXK(陕)2017-003。

将苦木水煎液(1g·mL-1), 脂溶性总 生 物 碱 (20 mg·mL-1)和 盐 酸 小 檗 碱 (2 mg·mL-1)于实 验 前 配 制 好 并 经 高 压 蒸 汽 灭 菌,置 于4 ℃冰箱 中,待 用｡小 鼠 耳 部 变 应 性 接 触 性 皮 炎 (ACD)诱导剂 DNFB的稀释基质为丙酮∶橄榄油= 4∶1,临 用 前 分 别 配 制 成 浓 度 为 2.5 和 5.0 μL·mL-1的 DNFB溶液。

将金黄色葡萄球菌､铜绿假 单胞菌､大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养 物分别接种于 TSB中,33 ℃培养18h,再分别用无菌 生理盐水10倍系 列 稀 释,使 其 含 菌 量 分 别 为3.2× 106,8.9×105,2.8×106和4.2×106 CFU·mL-1,备用。

采用试管二倍稀释 法,取灭菌试管10支,于第1~9管各加入 TSB2 mL,然后于第1管中加入苦木水煎液2mL,混匀后 取出2mL 加入第2管中,依此类推,直到第8管 中 取出2mL弃去,第9管作为 TSB对照,第10管作为 苦木水煎液对照｡分别于第1~9管中加入制备好的 金黄色葡萄球菌､铜绿假单胞菌､大肠埃希菌和乙型 副伤寒沙门菌菌液0.1mL,摇匀,33 ℃培养24h,以 不出现浑浊的质量浓度作为苦木水煎液的 MIC｡将 所有清晰 无 菌 生 长 的 试 管 培 养 液 取 1 mL 接 种 于 TSA 中,33 ℃培养24h,菌落数不超过5CFU 的质 量浓度作为苦木水煎液的 MBC｡以相同的方法测定 脂溶性总生物碱和盐酸小檗碱的 MIC和 MBC。

将32只小鼠适 应性饲养1周,随机分为空白对照组､模型组､阳性对 照 组 (丁 酸 氢 化 可 的 松 )和 苦 木 水 煎 液 组 (1 g·mL-1)｡于实验第1日用电剃须刀去除小鼠腹部毛 发,面积 3cm×3cm ;实验第2日,除空白对照组小鼠于腹部脱毛处涂以生理盐水外,其余各组小鼠均涂 以含 DNFB5.0μL·mL-1的丙 酮-橄榄 油 液25μL 进行首次致敏;实验第3日,同样剂量致敏剂强化致 敏1次;实验第8日,空白对照组小鼠于左耳背面处 涂生理盐水20μL,其余各组小鼠在给药结束2h,于 左耳背面处涂以含 DNFB2.5μL·mL-1的丙酮-橄 榄油液20μL诱发皮炎,且所有小鼠均于右耳背面处 涂抹丙酮-橄榄油基质20μL作为对照。

各组小鼠均于首次致敏后第2日开始给药,空白 对照组和模型组小鼠每日于左耳双面涂抹生理盐水, 阳性对照组小鼠每日在左耳双面用棉棒涂抹丁酸氢 化可的松乳膏0.15g,苦木水煎液组涂抹1g·mL-1 的苦木水煎液0.3mL(相当于0.3g,给药剂量参考 文献并根据前期预实验结果及生药含量确定)｡ 每日上午8时 和 下 午4时 各 涂 抹1次,涂 药 后 稍 按 摩,连续给药7d。

小鼠眼球后静脉丛取血0.5mL,室 温静置,以1000r·min-1离心15min,离心后吸取 上层血清,采 用 酶 联 免 疫 吸 附(Elisa)法检 测 小 鼠 血 清中IgE和IL-6的水平。

第9日 (诱发皮炎24h后),用游标卡尺测量并记录各组小 鼠左､右耳中部厚度,计算诱发皮炎后小鼠左､右耳厚 度差｡测量结束后,取小鼠左耳组织片用体积分数为 10%的甲醛溶液固定,常规进行石蜡切片后,苏木精- 伊红(HE)染色,显微镜下观察耳组织病理学变化。

实 验 数 据 用 x±s 表 示,应 用 SPSS17.0软件进行t 检验 统 计 分 析｡P<0.05表 示差异有统计学意义。

盐酸小檗碱体外 对溶血性链球菌､金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等多种 革兰阳性及阴性菌均具有抑制作用,本实验以盐酸小 檗碱为对照药,分别测定苦木水煎液和脂溶性总生物 碱对金黄色葡萄球菌､铜绿假单胞菌､大肠埃希菌和 乙型副伤寒沙门菌的 MIC和 MBC｡   苦木水煎液外用对小鼠耳厚度的影响 空白 对照组小鼠右耳经丙酮-橄榄油(4∶1)基质涂抹后与 左耳涂抹生理盐水比较出现了轻微肿胀,左耳平均厚 度低于右耳｡与空白对照组比较,模型组小鼠左耳肿 胀明显,左右耳厚度差显著增大(P<0.01)｡与模型 组比较,阳性对照组及苦木水煎液组用药后均能减轻 小鼠耳部肿胀症状(P<0.01)。