食用豆科植物皂苷和植物凝集素毒性试验

豆科植物在世界范围内普遍种植，广泛应用于食 品、化妆品和制药等领域，但由于加工不当，常引发 中毒类型的食源性突发公共卫生事件 。 豆科植 物中主要含植物凝集素和皂苷 2 种毒性物质，含有的 蛋白酶抑制剂、脂肪氧化酶和植酸等抗营养物质也会 促进中毒发生或者加重中毒症状。目前对豆科植 物食源性中毒诊断的实验室检验尚无统一的国家标 准，本研究选择常见豆类蔬菜——豆角，对其所含皂 苷和红细胞凝集素的毒性、溶血性和红细胞凝集性进 行了试验研究，为豆科植物食物中毒的实验室诊断提 供方法与评价依据。现将结果报道如下。

SPF 级 SD 大鼠，体重 180～220 g， 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许 可证号：SCXK- （京） 2012-0001。大鼠饲养于 SPF 级实验动物房，温度 20～25 ℃，相对湿度 40%～ 70%，合格证号：SYXK （津） 2014-0001。

荧光倒置显微镜 （日本奥林巴斯），ario Skan Flash 光栅型多功能酶标仪 （美国 Threom） ， Centrifuge 5810 高速离心机（德 国 Eppendorf），GNP-9050隔水式恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），多功能果蔬料理机，皂苷快速定性试剂盒，48 孔聚苯乙烯血凝 板，新鲜兔血、鸡血。

平行称取 50 g 豆角 4 份，150 g 豆角 4 份，分别于沸水中煮沸 0、3、5、10 min，冰 盒降温，吸去表面水分，果蔬料理机制成匀浆，并加 入生理盐水 30 mL，为不同煮沸时长Ⅰ号匀浆和Ⅱ号 匀浆。平行称取 150 g 豆角 4 份，同法制成匀浆，4 层纱布过滤，并加入生理盐水 30 mL，为不同煮沸时 长Ⅲ号滤液。

参照 GB 15193.3—2014 《急性经口毒性试验》，人用量按 200 g/60 kgbw 计 算。大鼠随机分为 8 组，每组 10 只，雌雄各半，状 态良好，同性别大鼠个体间体重差异不超过 15%。 大鼠经口灌胃 0、3、10 min 组Ⅰ号匀浆，剂量分别 为 20.0 g/kgbw （记为低剂量组，相当于人用量的 6 倍 ， 灌 胃 量 为 36、 30、 29 mL/kg） 和 40.0 g/kgbw （记为中剂量组，相当于人用量的 12 倍，灌胃量为 71、60、56 mL/kg）；经口灌胃 0、3 min 组Ⅲ号滤 液，剂量为 75.0 g/kgbw （记为高剂量组，相当于人 用量的 22 倍，灌胃量为 73、63 mL/kg；受试物 5 h 内分 2～3 次给予，观察 2 周内大鼠中毒症状和死亡情况。

取煮沸 0、3、5、10 min 的Ⅰ号匀浆和Ⅲ号滤液，采用皂苷快速定性试剂盒法 检测皂苷含量，若比色管出现淡黄色至砖红色可判断 为皂苷阳性，颜色越深表明皂苷含量越高。阴性对照 为生理盐水。

新鲜兔血脱纤维抗凝，配成 2%兔红细胞混悬液。取 ４ 种不同煮沸时长的Ⅱ号匀 浆和Ⅲ号滤液各 0.5 mL，加入 48 孔聚苯乙烯血凝板 为第 1 孔，从第 2 孔起用生理盐水倍比稀释，然后每 孔加入等量 0.5 mL 2%兔红细胞悬液，混匀，每个浓 度做 2 个平行孔，并设阴性对照 （生理盐水 + 2%兔 红细胞悬液） 和阳性对照 （蒸馏水+2%兔红细胞悬 液）。于 37 ℃恒温孵箱中静置，每隔 0.5 h 观察红细 胞溶解情况，观察 4 h。4 h 后，1 500 r/min 离心 10 min，取上清液，575 nm 处测定吸光度 （OD），计 算溶血率。溶 血 率 （%） = ［（ODt-ODn ）c / （ODpcODn ）c ］ ×100%。式中，ODt 为试验管吸光度，ODnc 为阴性对照管吸光度，ODpc 为阳性对照管吸光度。溶 血率＞5%为溶血。

新鲜鸡血脱纤维抗凝，配 成 1%鸡红细胞混悬液。取 4 种不同煮沸时长的Ⅱ号 匀浆和Ⅲ号滤液各 0.5 mL，加入 48 孔聚苯乙烯血凝 板为第 1 孔，从第 2 孔起用生理盐水倍比稀释，然后 每孔加入等量 0.5 mL 1%鸡红细胞悬液，混匀，每个 浓度做 2 个平行孔，并设阴性对照 （生理盐水 +1% 鸡红细胞悬液）。37 ℃恒温孵箱中静置，每隔 0.5 h 观察红细胞凝集情况，观察 4 h。4 h 后取出，若溶 液有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明 有红细胞凝集发生，并进一步判定是真凝聚还是假凝 聚：将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加生理 盐水，显微镜下观察，凝集红细胞能被冲散者为假凝 聚，记为“-”；否则为真凝聚，记为“+”。

采用 SPSS 21.0 软件统计分析，率的 组间比较采用 Fisher 确切概率法，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 受试物大鼠体内毒性试验结果 低、中剂量组 大鼠灌胃后约 0.5 h 出现趴卧 （染毒后临床症状）， 分别在 6 h 和 24 h 后基本恢复正常；高剂量组大鼠 灌胃后约 0.5 h 出现趴卧，24 h 后基本恢复正常。观 察期内大鼠体重呈增长趋势，大体解剖主要脏器未见 异常，无死亡个体。不同处理时间不同剂量组大鼠出 现趴卧症状的比例差异均无统计学意义 （P＞0.05）。 见表 1。
 

2.2.1 皂苷快速定性试剂盒法 0、3、5 min 组Ⅰ号 匀浆和Ⅲ号滤液比色后均出现淡黄色至棕红色变化， 为皂苷阳性，颜色随着煮沸时间的增加而变淡； 10 min 组Ⅰ号匀浆和Ⅲ号滤液均不显色。

2.2.2 溶血性试验结果 阴性对照组溶血率为 0，阳 性对照组溶血率为 100.00%。Ⅱ号匀浆 0、3、5、 10 min 组原液和 0、3、5 min 组 1∶2 稀释液的溶血 率均＞5%，溶血性试验结果阳性；Ⅲ号滤液 0、3、 5、10 min 组原液、1∶2 稀释液，3、5 min 组 1∶4、 1∶8 稀释液以及 3 min 组 1∶16 稀释液的溶血率均＞ 5%，溶血性试验结果阳性。见表 2。

3 讨 论

试验结果显示，新鲜豆角的大鼠急性经口毒性为 实际无毒 。NCIRI 等  研究发现，用未加工的 菜豆干豆粉 （Beldia，bean） 制成混悬液，经口灌胃 Wistar 大鼠，300 mg 连续 10 天，未见大鼠出现明显 的临床中毒症状或死亡。

本试验采用改良溶血试验评价豆角样品的溶血 性，利用全波长酶标仪比色，简化了检测步骤，对采 样量的要求更为灵活；红细胞凝集试验采用荧光倒置 显微镜观察，使结果判断更为直观准确。皂苷快速检 测、改良溶血试验和红细胞凝集试验法联合使用可初步判断豆科植物食源性中毒。今后研究应对皂苷和凝 集素进行提纯，以便提高检出率，消除干扰因素，同 时应考虑酸碱度 （pH 值）、温度和提取方法等对皂苷 和凝集素活性的影响，使这 2 种物质的毒性评价更加 可靠。