miR-122通过靶定LMNB2基因抑制肝癌细胞活性的研究

　肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）是常见的恶性肿瘤之一，也是导致癌症死亡的第二大常见原因。近年来，特别是亚洲国家的发病率和病死率有所增加。虽然手术切除和肝移植是治疗ＨＣＣ的主要方法，但大多数患者明确诊断时已处于ＨＣＣ晚期，失去手术机会，导致预后较差。虽然ＨＣＣ与多种表观遗传学和遗传学改变有关，但其发病的潜在分子机制尚不清楚，缺乏有效的生物标志物，严重制约着ＨＣＣ的早期诊断、预后评估和治疗。microRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码小ＲＮＡ分子，由２２个核苷酸组成，其主要功能是能够通过与靶ｍＲＮＡｓ的３′－ＵＴＲ结合，抑制靶ｍＲＮＡｓ的翻译或剪切，从而对靶基因进行转录后水平的调控。miRNAs与多种人类癌症的发生发展密切相关。研究发现，多种ｍｉＲＮＡ在肝癌发生发展过程中异常表达，这种异常的表达可以作为肝癌早期诊断、预后评估和治疗的有效靶点［１］。ｍｉＲ－１２２作为miRNAs家族的重要一员，其在肝癌进程中的作用机制受到人们的关注。有研究表明，miR-122可以通过影响丝氨酸／苏氨酸激酶、细胞周期蛋白Ｇ１途径抑制肿瘤进展，但是目前这些研究远远不能解释miR-122抑制肿瘤进展的作用机制，致使对miR-122功能的研究受到了很大的限制。本研究应用生物信息学软件预测miR-122可能的靶基因，并应用双萤光素酶实验及Westernblot实验进行验证，确定miR-122在肝癌细胞中的靶基因，进一步行体外细胞实验，验证miR-122及其靶基因对肝癌细胞生物活性的影响，旨在为深入研究ｍｉＲ－１２２在ＨＣＣ进程中的作用机制提供研究线索，并为临床探索ＨＣＣ早期诊断、治疗ＨＣＣ的有效途径提供可靠依据。

miR-122靶基因的生物信息学分析应用生物信息学软件microRNA.org、TargetScan和miRanda预测miR-122的可能的靶基因。

肝癌细胞培养人肝癌细胞株ＳＭＭＣ７７２１和Ｈｅｐ３Ｂ购自中国科学院。肝癌细胞株正常传代并维持于含有１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基中，于含有５％ＣＯ２的３７℃细胞培养箱中培养。双荧光素酶报告基因实验将ＬＭＮＢ２ＵＴＲ的野生型和突变体插入荧光素酶下游，分别构建ｐＧＬ３－ＬＭＮＢ２ＵＴＲＷＴ和ｐＧＬ３－ＬＭＮＢ２ＵＴＲＭｕｔ质粒，并转染到ＳＭＭＣ７７２１细胞中，同时在ＳＭＭＣ７７２１细胞中转染miR-122ｍｉｍｉｃｓ。使用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性。并应用肾荧光素酶活性对结果进行标准化。

Westernblot实验将对数生长期的人肝癌细胞株Ｈｅｐ３Ｂ和ＳＭＭＣ７７２１接种于６孔板中常规培养，待细胞株生长至８０％时，分别转染miR-122ｍｉｍｉｃｓ和miR-122ＡＳＯ，各组均设立空白对照。继续培养４８ｈ后每孔加入ＲＩＰＡ裂解液进行细胞裂解，４℃环境作用３０ｍｉｎ，收集上清定量，然后按比例与上样缓冲液混匀，１００℃煮５ｍｉｎ后放置１０ｍｉｎ，应用１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上。应用５％脱脂牛奶封闭２ｈ，加入ＬＭＮＢ２抗体（１∶１０００）和β－ａｃｔｉｎ抗体（１∶５０００），４℃过夜，应用ＴＢＳＴ洗涤。加入抗兔抗体（１∶２５００），室温下孵育１ｈ，加入发光试剂，于暗室曝光、压片、显影、定影。测定靶基因条带亮度值，绘制柱状。

针对目前的研究现状，本研究应用生物信息学软件预测miR-122的靶基因，并应用荧光素酶报告基因实验和Westernblot实验证实miR-122对靶基因的调控作用。然后应用菌落形成试验和Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞侵袭实验分析靶基因对肝癌细胞生物活性的影响。最终发现ＬＭＮＢ２是miR-122的下游靶基因；miR-122可降低肝癌细胞中ＬＭＮＢ２的表达；在肝癌细胞Ｈｅｐ３Ｂ中过表达ＬＭＮＢ２可促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭；在肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１中抑制ＬＭＮＢ２表达，可降低肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。总之，miR-122可以通过靶定ＬＭＮＢ２抑制肝癌细胞的生物活性，其可以作为肝细胞肝癌早期诊断指标及治疗靶点。