鹅源性成分特征肽分析（精宏DNP-9272使用）

肉类含人体所需的蛋白质、脂肪和维生素等营养成分，是人们必需的主要副食品之一。从波及欧盟多 国的“马肉风波”到国内的“老鼠肉、狐狸肉和水貂肉冒充羊肉”等事件，不仅严重损害了消费者的权益， 同时也带来了诸多食品安全隐患，还可能涉及宗教信仰问题，引发社会的不安定因素。近年来，用于物种 鉴别和食品鉴定的方法在食品工业领域和监管机构中得到越来越多的关注。肉类真实性鉴别最常用的 检测方法主要有聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）技术。但这两种方法都存在一 定的弊端，核酸的降解和肉品的复杂基质会影响 ＰＣＲ检测结果的准确性，而 ＥＬＩＳＡ 易发生物种间的交叉 反应产生假阳性结果，而且无法实现多个物种的同时检测。

１ 实验部分

１．１ 仪器与设备

ＥｋｓｐｅｒｔＴＭｎａｎｏＬＣ４００纳升液相色谱－飞行时间质谱联用 仪（ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ６６００，美 国 ＡＢＳＣＩＥＸ公司）；ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ 超高效液相色谱仪（美国，Ｗａｔｅｒｓ公司）；ＱＴＲＡＰ６５００＋三重四极杆－线性离子 阱复合质谱仪（美国，ＡＢＳＣＩＥＸ公司）；ＨｅｒａｅｕｓＦｒｅｓｃｏ２１型冷冻离心机（美国，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）； ３－３０Ｋ 型高速冷冻离心机（德国，Ｓｉｇｍａ公司）；精宏DNP-9272型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；ＢＣ－１０００涡旋振荡器（深圳逗点生物技术有限公司）；ＣＰＡ２２４Ｓ型分析天平（德国，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）；低 蛋白吸附离心管（１．５ｍＬ，德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）；刻度离心管（１０ｍＬ，美国 ＡｘｙｇｅｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）；超滤 离心管（Ｍｅｍｂｒａｎｅ：１０，０００ＭＷＣＯ ＨＹ，德国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ公司）。

１．２ 材料与试剂

碳酸氢 铵 （分 析 纯，国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司）；硫 脲 （ＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ ≥９９．０％，美 国 Ｓｉｇｍａ－ Ａｌｄｒｉｃｈ公司）；３－［３－（胆酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐（ＣＨＡＰＳ）（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ，ＶＷＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）、尿素 （ＶＷＲＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）、二硫苏糖醇（ＤＴＴ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、碘乙酰胺（ＩＡＡ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）（美国 Ａｍｒｅｓｃｏ公 司）；测序级修饰胰蛋白酶（Ｐｏｒｃｉｎｅ，美国 Ｐｒｏｍｅｇａ公司）；Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白浓度测定试剂盒（生工生物工程上 海股份有限公司）；乙腈、水（质谱纯，德国 Ｍｅｒｃｋ公司）；甲酸（质谱纯，美国 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公司）。实验 前处理用水均为超纯水。 鸡肉、鸭肉、鹅肉、猪肉、牛肉和羊肉样品均为市售。

１．３ 样品处理

１．３．１ 蛋白质提取

称取１ｇ切碎后的肉类样品于１０ｍＬ离心管中，加入５ｍＬ蛋白裂解液（７ｍｏｌ／Ｌ 尿 素，２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，４％ＣＨＡＰＳ），涡旋振荡过夜，以１４０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液至低蛋白吸附离心 管中备用。采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定上清液蛋白浓度。

１．３．２ 蛋白质酶解

根据测定的蛋白浓度，移取适量上清液到低吸附离心管中，加入尿素水溶液（８ｍｏｌ／Ｌ） 至２００μＬ，加入４μＬＤＴＴ水溶液（１ｍｏｌ／Ｌ），置于３７℃恒温反应１ｈ。冷却至室温后加入２０μＬＩＡＡ 水溶 液（１ｍｏｌ／Ｌ），避光反应１ｈ。将上述反应液转移至超滤离心管中，于８℃、１４０００ｒ／ｍｉｎ离心４０ｍｉｎ，除去 多余的ＩＡＡ 和盐类等小分子成分，并用碳酸氢铵溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）洗涤超滤膜上的蛋白３次（１００μＬ× ３）。向超滤管中加入１００μＬ碳酸氢铵溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）和１０μＬ胰蛋白酶溶液（１∶４０），轻轻摇匀，置于 ３７℃恒温酶解５ｈ，８℃、１４０００ｒ／ｍｉｎ离心４０ｍｉｎ，加入９０μＬ碳酸氢铵溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）洗涤一次，收 集滤液，待质谱分析。

１．４ ＮａｎｏＬＣ－ＴＯＦＭＳ条件

色谱条件：ＥｋｓｉｇｅｎｔＮａｎｏＬＣｔｒａｐＣ１８色谱柱（０．５ｍｍ×３５０μｍ，３μｍ），ＥｋｓｉｇｅｎｔＣ１８色谱柱（１５０ ｍｍ×７５μｍ，３μｍ）。流动相 Ａ 为含０．１％甲酸水溶液－乙腈（９８∶２，Ｖ／Ｖ），Ｂ为乙腈－含０．１％甲酸水溶液 （９８∶２，Ｖ／Ｖ）。梯度洗脱程序：０～０．５ｍｉｎ，９５％～９２％Ａ；０．５～５０ｍｉｎ，９２％～７６％Ａ；５０～６５ｍｉｎ，７６％ ～６８％Ａ；６５～７４ｍｉｎ，６８％～５０％ Ａ；７４～７５ｍｉｎ，５０％～２０％ Ａ；７５～８０ｍｉｎ，２０％ Ａ；８０～８１ｍｉｎ，２０％ ～９５％ Ａ；８１～９０ｍｉｎ，９５％ Ａ。流速：３００ｎＬ／ｍｉｎ；进样体积：２μＬ。 质谱条件：采用纳升电喷雾离子源（ＮａｎｏＥＳＩ），正离子扫描模式，喷雾电压２．３ｋＶ；加热温度１５０℃； 气帘气压 力２０６．８４ｋＰａ，雾 化 气 压 力４１．３７ｋＰａ；质 谱 数 据 采 集 使 用 信 息 依 赖 的 工 作 模 式（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ，ＩＤＡ）同时进行动态背景扣除。一级 ＴＯＦ－ＭＳ单张图谱扫描时间为２５０ｍｓ，扫描范 围：ｍ／ｚ３５０～１５００；每次ＩＤＡ 循环最多采集３０张电荷为２＋～５＋且单秒计数大于１５０的二级质谱，每 张二级质谱的累积时间为５０ｍｓ，每次循环时间为１．８ｓ。

１．５ ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ条件

色谱条件：ＡｇｉｌｅｎｔＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ 色 谱 柱 （１００×２．１ ｍｍ，１．８μｍ），柱 温：３５ ℃。流 动 相 Ａ 为 ０．１％甲酸，流动相 Ｂ为乙腈。梯度洗脱程序：０～０．５ｍｉｎ，９５％Ａ；０．５～４ｍｉｎ，９５％～６５％ Ａ；４～７ｍｉｎ， ６５％～５０％Ａ；７～８ｍｉｎ，５０％～１０％Ａ；８～１０ｍｉｎ，１０％Ａ；１０～１０．５ｍｉｎ，１０％～９５％Ａ；１０．５～１２ｍｉｎ， ９５％Ａ。流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ；进样体积：４μＬ。 质谱条件：采用电喷雾离子 源（ＥＳＩ）源，正 离 子 扫 描 以 多 反 应 监 测（ＭＲＭ）模 式 检 测；喷 雾 电 压：５．５ ｋＶ；离子源温度：５５０℃；气帘气压力：２７６ｋＰａ；雾化气压力：３７９ｋＰａ；辅助气压力：３７９ｋＰａ。

２ 结果与讨论 

胰蛋白酶在ｐＨ 为８．０、温度为３７℃时的作用能力最强，因此酶解反应在ｐＨ 相近的碳酸氢铵溶液中 进行，温度控制在３７±０．５℃左右。在上述实验条件下，酶解的时间是影响蛋白质水解程度的重要因素， 实验考察了酶解２、４、６、８、１５ｈ（过夜）后质谱记录的各特征肽段的检测浓度。结果表明，鹅肉样品的酶解 时间为４ｈ时，各肽段的检测浓度达最高值且随后趋于平衡。为了充分水解蛋白质并缩短实验前处理时 间，酶解的反应时间选为５ｈ。特征肽段是指某一个蛋白质所特有的肽段序列，在蛋白质组学研究中可作为 区分物种属性的生物标志物。特征肽段的选择一般遵循以下原则：以含７～２５个氨基酸长度的肽为 宜；不含错切或漏切的酶切位点，对于丰度较高的肽段可接受一个漏切位点；要具有稳定的物理化学性质； 质谱检测分析时具有较好的灵敏度和峰形。借助于纳升液相色谱－串联飞行时间质谱仪对酶解后的多肽 溶液进行 ＦｕｌｌＭＳ－ＩＤＡ 扫 描，得到高准确质量数的质谱数据。将数据导入蛋白质搜索软件 ＰｒｏｔｅｉｎＰｉ－ ｌｏｔＴＭ ，参数 设 置 为：ＳａｍｐｌｅＴｙｐｅ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＣｙｓＡｌｋｙｌａｔｉｏｎ：Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ；Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ｔｒｙｐｓｉｎ；Ｉｎ－ ｓｔｒｕｍｅｎｔ：ＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ６６００；ＩＤ Ｆｏｃｕｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｕｎｕｓｅｄ ＰｒｏｔＳｃｏｒｅ（Ｃｏｎｆ）＞ ０．０５ （１０．０％）；ＲｕｎＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＲａｔｅＡｎａｌｙｓｉｓ，并在 Ｕｎｉｐｒｏｔ蛋白数据库中进行比对检索。本文详细比较 了鸡肉、鸭肉、鹅肉、猪肉、牛肉和羊肉这些常见物种的多肽序列，找到６０条只存在于鹅肉样品中的备选特 征肽段，然 后 在 ＮＣＢＩ网 站 上 进 行 ｂｌａｓｔ分 析，去 掉 非 特 异 性 的 肽 段，最 后 留 下７条 特 异 性 肽 段。利 用 Ｓｋｙｌｉｎｅ软件导出上述７条异性肽段的 ＭＲＭ 离子对信息，并对离子对的碰撞能量进行优化，建立 ＵＰＬＣ－ ＭＳ／ＭＳ方法。

３ 结论

本研究利用纳升高效液相色谱－串联飞行时间质谱平台，结合蛋白质检索软件筛选出鹅的备选特征肽 段，利用ｓｋｙｌｉｎｅ软件导出的质谱参数，建立了 ＭＲＭ 检测方法，并对备选特征肽段进行验证，最终确证了 ７条鹅源性特征肽段。另外，所筛选的特征肽段中有６条肽的质谱信号与鹅肉含量呈线性相关，能够准确 地定量鹅肉成分。



 

免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。