小鼠皮肤创伤愈合效果研究（精宏搅拌器使用）

香港牡蛎 Crossostrea sikamea 广泛分布于中国 广东、广西海域，其肉质鲜美、营养丰富全面，素 有 “海洋牛奶”之美名。牡蛎是第一批入选食 药同源的食物，其具有抗氧、免疫、抗疲劳、抗肿瘤、抑菌、改善记忆、解酒护 肝等功能活性，这为进行创伤愈合研究奠定了 理论基础，但尚未有对其进行深入的营养保健或药 用价值相关报道，因此，有必要对牡蛎的功能价值 进行充分开发利用。

1 材料与方法

1. 1 材料

试验用牡蛎肉购自广西钦州。试验用 SPF 级 昆明小鼠体质量为 ( 20±2) g，雄性，购自山东省 济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验单位使用许 可证编号 SYXK ( 粤) 2014－0053。云南白药购自 云南白药集团。抗菌试验所需菌株由广东省水产品 加工与安全重点实验室提供。 试验试剂: 动物蛋白酶 ( 3 万 U/g) 购自广西 南宁庞博生物工程有限公司; 白介素－6 ( interleukin 6，IL － 6) 、白 介 素 － 10 ( interleukin 10，IL － 10) 、生长因子转化生长因子 β ( transforming growth factor－β，TGF－β) 、碱性成纤维细胞生长因 子 ( fibroblast growth factor 2，FGF－2) 、表皮细胞 生长因子 ( epidermal growth factor，EGF) 、细胞生 长周期素 1 ( Cyclin D1，CCND1) 和羟脯氨酸测定 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 试验仪器: Lynx 6000 型高速冷冻离心机、多 功能酶标仪购自 Thermo 公司; BSA224S－CW 型万 分之一电子天平购自赛多利斯科学仪器 ( 北京) 有限公司; FE28 型 pH 计购自梅特勒—托利多仪 器 ( 上海) 有限公司; DF－101T 集热氏恒温加热 磁力搅拌器购自上海精宏实验设备有限公司; FDU－1110 型冷冻干燥机购自上海爱朗仪器有限公 司; SW－CJ－2FD 型双人超级操作台，苏州净化设 备有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 EPO 制备工艺

将牡蛎肉清洗、打浆，pH 值调至 7. 0，加入 1000 U/g ( 蛋白) 的动物蛋白 酶，酶解 5 h，灭酶 10 min，以 8000 r/min 离心， 浓缩，冷冻干燥。采用凯氏定氮法、甲醛滴 定法和双缩脲法分别测定蛋白质含量、水解度 和肽含量。

1. 2. 2 EPO 体外抗菌试验

采用微量径向扩散法 和半数稀释法测定 EPO 对 6 中革兰氏阳性菌和 7 种革兰氏阴性菌的抗菌活性。

1. 2. 3 EPO 体表促凝血试验

用断尾法测定 EPO 对小鼠体表创口出血时间和出血量的影响。

1. 2. 4 EPO 急性皮肤毒性试验

选取 SPF 级昆明 小鼠 10 只，随机分成空白对照组和 EPO 涂抹组。 试验方法参考。

1. 2. 5 动物分组及创伤模型建立

选取 SPF 清洁 级昆明雄性小鼠 60 只，随机分为 3 组，每组 20 只，分别为阴性对照组、云南白药阳性对照组和 EPO 给药组。将小鼠用 10%水合氯醛腹腔麻醉后， 背部剃毛、消毒。在小鼠背部剪去直径约 0. 8 cm 的全层皮肤，造成全皮层创伤动物模型。每只小鼠 均分笼饲养，给药组每天涂抹 30 ～ 35 mg EPO ( 肽 含量为 1. 5 ～ 2. 5 mg) ，阳性对照组每天涂抹 2 ～ 3 mg 云南白药，阴性对照组不做任何处理。每 2 天 对小鼠创伤口面观察、拍照、测量伤口大小，并记 录结果。

1. 2. 6 愈合率及瘢痕缩小率

每隔 2 d 用游标卡 尺测量创面直径大小一次，计算创伤愈合率: 创伤愈合率= ( 第 0 天创面直径－第 n 天创面 直径) /第 0 天创面直径×100%， 瘢痕缩小率= ( 第 0 天创面直径－第 14 天瘢痕 长度) /第 0 天创面直径×100%。

1. 2. 7 瘢痕组织中生化指标测定

小鼠创面组织 匀浆液制备，分装于－80 ℃ 下保藏 待测。IL－6、IL－10、TGF－β、FGF－2、EGF、CCND1 和羟脯氨酸含量的检测均按照试剂盒说明书 进行。

1. 3 数据处理

试验数据采用平均值 ±标准 差 表 示 ( mean ± S. D. ) ，每组试验至少重复 3 次，采用 SPSS 20 软 件进行统计学分析。组间比较采用 LSD 检验，显 著性水平设为 0. 05。

2 结果与分析

2. 1 牡蛎酶解产物 ( EPO) 的基本性质

本试验中自制的 EPO 主要质量指标为加酶量 为 1000 U/g， 蛋白的牡蛎酶解液水解度为 26. 33%，EPO 的蛋白质含量为 43. 54 g /100 g，肽 含量为 25. 26%。

2. 2 体外抗菌试验结果

采用微量径向扩散法和半数稀释法测定 EPO 对常见的 13 种菌株的抑制作用，其中 6 种革兰氏 阳性菌株分别为金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus、芽孢杆菌 Bacillus、李斯特菌 Listeria monocytogenes、海豚链球菌 Streptococcus iniae、格氏乳球 菌 Lactococcus garviea 和 无 乳 链 球 菌 Streptococcus agalactiae，7 种革兰氏阴性菌分别为大肠 杆 菌 Escherichia coli、铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa、溶藻弧菌 Vibrio alginolyticus、副溶血性弧菌 V. Parahemolyticus、海藻希瓦氏菌 Shewanella algae、 哈氏弧菌 V. harveyi 和嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila。体外抗菌试验结果显示，EPO 无抗菌活 性。

2. 3 体表促凝血试验结果

EPO 对小鼠体表创口出血时间和出血量的影 响如表 1 所示，与阴性对照组相比，EPO 可缩短 出血时间和减少出血 量，但无显著性差异 ( P ＞ 0. 05) ，而云南白药阳性对照组则极显著好于其他 组 ( P＜0. 01) 。这表明，EPO 不具有促凝血作用。

2. 4 EPO 急性皮肤毒性试验结果

连续涂抹 EPO 3 d 后，所有小鼠均未出现红斑 和水肿现象。停药后继续观察 2 d，也未出现红斑 和水肿，且均未出现动物体质量下降、站立不稳、 精神萎靡等其他异常变化。这表明，EPO 对小鼠 无毒性。

2. 5 EPO 对小鼠皮肤伤口愈合作用的影响

各组愈合情况如图 1 所示，造模后第 2 天，各试验组动物皆已结痂，伤 口周围出现红肿，无液体渗出，伤口收缩均不明 显。第 2、4 天时，各组创面结痂局部不断变硬， 创伤周围表面不平整，创缘皮肤收缩较明显。第 6、8、10 天时，阴性对照组伤口结痂不断变厚， 呈黑红色，但瘢痕面积变化小; 阳性对照组伤口缩 小，并开始部分脱痂、缩痂明显; EPO 给药组在 第 6 天时已掉痂，缩痂明显优于两对照组。第 12 天时，各组皆已掉痂，愈合处开始长出毛发，其中 给药组进一步缩痂。第 14 天时，阴性对照组的多 数伤口直径小于 2 mm，各给药组伤口直径均小于 1 mm，呈现肉红色新生皮肤，新生肉色组织完整。 给药组较阴性对照组愈合情况良好，无增生性瘢痕 及瘢痕疙瘩生成。

3 结论

本研究中针对皮肤创伤愈合全阶段试验指标的选择，进行体外试验及涂抹给药的动物试验，结果 表明，在皮肤创伤愈合过程中，涂抹牡蛎酶解产物 通过抑制炎症作用，促进生长因子分泌及胶原蛋白 的沉积与交联，从而加快了小鼠软组织开放性创伤 愈合，且对浅表瘢痕增生具有一定的抑制作用。本 研究发现并开拓了皮肤创伤愈合活性物质的来源， 但其具体作用功能因子尚不确定且机理不明，后续 试验将对牡蛎酶解产物进行分离纯化，以进一步阐 释其机理。



 

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