窖泥中酯化型细菌的筛选（精宏摇床使用）

浓香型白酒产销量在各香型中位居首位，其产量和质 量深度影响着我国白酒产业的发展。浓香型白酒以泥窖 池为发酵容器，窖泥的质量直接影响白酒品质的优劣。 窖泥中的微生物种类丰富，是酿制浓香型白酒的基础。酯 化型微生物是窖泥中一类重要的功能菌。在发酵过程中， 酯化菌代谢产生的酯化酶使乙醇与己酸、乙酸、乳酸等有 机酸缩合，生成己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯类，构 成浓香型白酒的主体香成分。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

窖泥：赊店老酒股份有限公司。

1.1.2 化学试剂

三丁酸甘油酯（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；环己烷（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；正己 酸（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；无水乙醇、葡萄 糖（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；细菌 基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试 剂盒：天根生化科技有限公司；2×EsTaq Master Mix：北京 康为世纪生物有限公司；DL2000 Marker：北京博迈德生物 技术公司；可溶性淀粉（生化试剂）：天津市恒兴化学试剂 制造有限公司；高粱粉（食品级）、玉米面（食品级）：河南省 新乡市原阳县农家自产；红糖（食品级）：北京德众嘉鑫经 贸有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星 生物技术有限责任公司；琼脂粉（生化试剂）：北京索莱宝 科技有限公司。

1.1.3 培养基

液体培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L， 121 ℃灭菌30 min。 初筛培养基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L， 琼脂粉20 g/L，加入三丁酸甘油酯1%，121 ℃灭菌30 min。 发酵培养基：牛肉膏20.0 g/L，葡葡糖20.0 g/L，K2HPO4 1.0 g/L，（NH）4 2SO4 1.0 g/L，MgSO·4 7H2O 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L， FeSO·4 7H2O 0.01 g/L，调pH至7.0，121 ℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

H1850R离心机：湖南湘仪实验仪器开发有限公司； ZQLY-300S恒温培养摇床：上海精宏试验设备有限公司； JA1003分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；DNP9272BS电热恒温培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司； DYY-2C电泳仪：北京六一生物科技有限公司；D-37085聚 合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 ：德国 Senso Quest有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离纯化

称取5 g窖泥于45 mL无菌水中，充分振荡，取上清液 用无菌水逐级稀释，得到10-2～10-3稀释度的菌悬液。吸取 上述菌悬液各100 μL，分别涂布于初筛培养基上，每个稀 释度做两个平行。将涂布均匀的平板置于30 ℃恒温培养箱 中，培养24～48 h，观察在菌落周围出现的透明圈，将产圈 菌落于平板初筛培养基上划线分离至纯种。

1.3.2 菌种初筛

将分离出的菌株点植于初筛培养基中，每个菌株做三 个平行，于30 ℃恒温培养箱中培养24 h。观察菌落周围出 现的透明圈，记录透明圈直径（D）与菌落直径（d）之比，选 取D/d值较大者进行复筛。

1.3.3 菌种复筛

将初筛后的菌株接种于5 mL/25 mL液体培养基中， 30 ℃、150 r/min摇床培养19 h，取1 mL转接于50 mL/250 mL 液体培养基中，同样条件下再次培养19 h，以5%的接种量将种子液接入发酵培养基中，30 ℃、150 r/min培养48 h。发 酵液经10 000 r/min离心10 min，取上清液于4 ℃保存，备用。

1.3.4 酯化酶活力的测定测定方法

于10 mL环己烷体系中加入正己酸和无水 乙醇，己酸量为6.25 mL，无水乙醇与己酸体积比为1.0∶1.8 （上述试剂每500 mL加入无水硫酸钠30 g），并向其中加入 0.2 mL酶液，于37 ℃条件下保温酯化24 h。吸取上清0.5 mL 于100 mL三角瓶中，加入5 mL蒸馏水，2滴酚酞，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至终点，记录消耗NaOH溶液体积。 酯化酶酶活力定义：在37 ℃条件下，每分钟消耗1 μmol 己酸需要的酯化酶量为1个酶活力单位（U/mL）。

1.3.5 菌种鉴定

（1）形态学鉴定 将产酶活力较高的菌株于固体培养基中划线培养24 h， 观察菌落的大小、颜色、表面形态、质地、边缘形状和高度 等并做记录，菌株经革兰氏染色观察细胞形态，经孔雀绿 染液染色观察芽孢形态。
（2）分子生物学鉴定 采用试剂盒法，提取菌株S2D27的基因组脱氧核糖核 酸（deoxyribonucleic acid，DNA），用细菌的通用引物（27F 和1492R）对提取的DNA进行PCR扩增，扩增产物送由上 海生物工程有限公司进行测序。根据测序结果，选择准确 度较高的基因序列，从GenBank数据库中搜索有关种的公 认16S rDNA标准序列数据进行比对，并使用MEGA6.0构建 系统发育树。

1.3.6 菌株培养基优化

最适碳源及其最适碳源添加量的确定：分别以2%的葡 萄糖、可溶性淀粉、高粱粉、红糖、玉米面替代发酵培养基 中的碳源，其他成分不变。按5%的接种量，接入摇床培养 19 h的菌液，于30 ℃、150 r/min摇床培养48 h，测定酯化酶活 力，优选出最佳碳源。再分别调节最适碳源添加量为1.0%、 1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，同时测定酯化酶活力，以确定其 最适碳源添加量。 最适氮源及其最适氮源添加量的确定：分别以2%的蛋 白胨、牛肉膏、酵母浸粉、豆粕、硝酸铵替代发酵培养基中 的氮源，其他成分不变。接入5%的菌液，于30 ℃、150 r/min 摇床培养48 h，测定酯化酶活力，优选出最佳氮源。调节最 佳氮源的添加量为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，测定酯 化酶活力以确定其最适氮源添加量。

1.3.7 菌株发酵条件优化单因素试验

考察初始pH值（4、5、6、7、8）、接种量（3%、5%、7%、9%、 11%）及培养时间（2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）对酯化酶活力的影响。 1.3.8 菌株发酵条件优化响应面分析试验使用Design-Expert软件，在单因素试验的基础上，选取 豆粕添加量（A）、培养基初始pH值（B）、培养时间（C）3个对产酶影响较大的因素为自变量，以酯化酶活力（Y）为响 应值，进行响应面试验。

2 结果与分析

菌株S2D27产 酯化酶活力最高，可达10.43 U/mL，其他菌株产酯化酶活 力在7.08～9.63 U/mL。因此，选择菌株S2D27作为出发菌 株，对其进行形态观察、分子生物学鉴定及最适发酵条件 的优化。菌株S2D27的16S rDNA序列碱基长度为1 480 bp 左右，与预期结果相符。扩增产物送由生工生物工程（上海） 股份有限公司进行测序，将测序结果于美国国家生物技术 信息中心（national center of biotechnologyinformation，NCBI） 上使用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析比对，发现菌株S2D27与贝莱斯芽孢杆菌 （Bacillus berezoensis）同源性较高，达到99%。选取9株与菌株 S2D27同源性较高的16S rDNA标准序列数据构建系统发育树，菌株S2D27与Bacillus berezoensis （MG234434.1）聚于同一支，因此，鉴定菌株S2D27为贝莱 斯芽孢杆菌（Bacillus berezoensis）。

3 结论

通过透明圈法从窖泥样品中筛选得到一株酯化酶活力 较高的菌株S2D27，经分子生物学鉴定为贝莱斯芽孢杆菌 （Bacillus berezoensis）。以此菌株为出发菌株，对其最适发 酵条件进行了研究，在单因素试验的基础上，以豆粕添加 量、培养基初始pH值及培养时间为自变量，以酯化酶活力 为响应值，进行响应面试验。结果表明，在豆粕添加量为 1.3%、初始pH值为5，培养时间3 d条件下，菌株酯化酶活 力可达17.25 U/mL，是优化前的1.65倍。

 

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