分享羊肚菌总提物对阿尔茨海默症大鼠学习记忆

阿尔茨海 默 症（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ＇ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ），又 称 为老年痴呆症或早老性痴呆症，是老年期常见的一种 以 认 知、记忆障碍为主要特征的神经退 行性疾病。 ＡＤ的发生和 发 展 是 细 胞 和 生 物 体 内 复 杂 的 调 节 网 络和调节因子相互作用的结果。中医药多靶 点 和 多 环节作用的特点，使其在增强疗效、改善患者 生 活 质 量、降低化学药物剂量和减少化学药物毒副作用等方 面具有优 势。中 医 药 未 病 先 防、既 病 防 变 的 独 特 优 势，使其在延缓疾病的发生发展中发挥了积极作用。 因此，中药成为挖掘防治 ＡＤ 新 药 的 重 要 资 源，而 药 食两用中药因具有药性平和、不良反应少等 特 点，成 为“治未病”的首选药物。

１ 材料与方法

１．１ 实验动物

ＳＰＦ级健康雄性ＳＤ大鼠２５只，体重１６０±１０ｇ， 由三峡大学实验动物中心提供，实验单位许可证编号 ＳＹＸＫ（鄂）２０１７－００６１，动物批号４２０１０２００００２１２５。

１．２ 主要仪器和试剂

ＳＤ－１００旋转蒸发仪（日本 ＥＹＥＬＡ 公司），ＨＥＶ－ ５０自动灭菌锅（日本 ＨＩＲＡＹＡＭＡ 公司），Ｍｏｒｒｉｓ水 迷宫视频 跟 踪 分 析 系 统（成 都 泰 盟 软 件 有 限 公 司）， Ｉｎｆｉｎｉｔｅ? ２００ 酶 标 仪 （上 海 安 景 科 技 有 限 公 司 ）， ５４１５Ｒ小型台式高速冷冻离心机（德国艾本德股份公 司），精宏DK-8A电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）。９５％乙醇（天津市天力化学试剂有限公司）， 东莨菪碱（上海安谱科学仪器有限公司），蛋白定量测 试盒、ＡＣｈＥ试 剂 盒、ＳＯＤ 测 试 盒、ＭＤＡ 测 试 盒（南 京建成生物工程研究所）。

１．３ ＭＥＥ的制备

１．３．１ 菌种活化及发酵培养

①制备马铃薯提取液：去皮马铃薯１００ｇ，切成小 块加水至 １．０Ｌ，煮沸３０ｍｉｎ，直至马铃薯块软化，滤 去马铃薯块，将 滤 液 补 足 至１．０Ｌ；
②菌 种 活 化 培 养 基：马 铃 薯 提 取 液 １．０Ｌ，葡 萄 糖 ２０．０ｇ，ＭｇＳＯ４ · ７Ｈ２Ｏ１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４３．０ｇ，琼脂１５．０ｇ，维生素 Ｂ１ 微量；
③ 发 酵 培 养 基：马 铃 薯 提 取 液 ５．０Ｌ，葡 萄 糖１００．０ｇ，ＭｇＳＯ４ ·７Ｈ２Ｏ７．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １５．０ｇ，酵 母 ＦＭ８８８５０ｇ，维生素 Ｂ１ 微量，ｐＨ６．０；
④将菌种活 化培养基和发酵培养基于１２１℃、０．１ ＭＰａ灭菌箱中 灭菌 ３０ｍｉｎ，灭菌后将菌种活化培养基倒于１２ｍｍ 灭菌平板中凝固，后取保种管中羊肚菌菌种，接 种 于 灭菌平板中，于２７℃ 培养６～８ｄ，羊肚菌长满平板， 菌丝灰白色。将活化后的羊肚菌接种于发酵培养基 中，２７℃培养 ３０～４０ｄ。

１．３．２ 羊肚菌菌丝体提取

收集羊肚菌菌 饼，５０℃条 件 下 烘 干，称 重 后 即 为 羊肚菌干菌丝体质量，粉碎后，使用９５％乙醇７０℃条 件下加热回流提取３次，每次提取时间为２～３ｈ，过 滤，合 并 滤 液，用 旋 蒸 仪 在６５℃下 对 滤 液 浓 缩，得 到 总提物浓缩液，浓缩液挥干溶剂后得到 ＭＥＥ浸膏。

１．４ 实验动物分组及 ＡＤ模型的建立

取健康雄性 ＳＤ（１６０±１０ｇ）大 鼠２５只，随 机 分 为５组，每 组 ５ 只，即 空 白 组、东 莨 菪 碱 模 型 组、低 （１００ｍｇ／ｋｇ）、中（２００ｍｇ／ｋｇ）、高（４００ｍｇ／ｋｇ）剂量 ＭＥＥ 组。 给 药 组 每 天 按 体 重 给 药，给 药 容 积 为 １０ｍＬ／ｋｇ，空白组和 模 型 组 每 天 给 予 等 量 的 生 理 盐 水，连续灌胃１０ｄ后进行水迷宫测试，每天对大鼠进 行称重记录。 本研究采 用 腹 腔 注 射 东 莨 菪 碱 的 方 法 建 立 ＡＤ 动物模型，ＭＥＥ末次给药１ｈ后，除空白组给予等体 积生理 盐 水 外，其他各组大鼠 腹腔注射东莨菪碱 （２ｍｇ／ｋｇ），造成记 忆 获 得 障 碍 模 型，３０ ｍｉｎ后 进 行 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试。

１．５ Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试

Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫测试包括定位航行实验和空间搜 索实验。造模３０ｍｉｎ后，开始进行定位航行实验，水 温２０℃左右，每天每只大鼠训练６次，每一次将大鼠 从平台位置的对面放入水中，记录其在１２０ｓ内寻找 到平台的时间（即实验中设定的逃避潜伏期），连续训 练６ｄ。如果大鼠在１２０ｓ内未找到平台，则牵 引 至 平台上，让大鼠停留１５ｓ，再放回笼中，其逃避潜伏期 记为１２０ｓ。 第７ｄ进行空间搜索实验，撤 除 平 台，任 选 一 个 入水点将大鼠放入，记录其１２０ｓ内跨越原平台位置 的次数，同时记录大鼠在目标象限的时间，路 程 以 及 大鼠在１２０ｓ内运动的总路程，结果以目标象限距离 百分比（％）表示。

１．６ 组织样本采集

空间搜索实验结束后第２ｄ采集标本。实验前， １０％水合氯醛 以１０ ｍＬ／ｋｇ给 药 体 积 进 行 腹 腔 注 射麻醉，腹主动脉取血，然后迅速取出大脑，用称量纸称 取重量，按脑组织重量（ｇ）与生理盐水体积（ｍＬ）比为 １∶９，冰水浴条件下进行组织匀浆，２０００ｒ／ｍｉｎ× １５ｍｉｎ，取上清液，－２０℃下冷冻保存。

１．７ 生化指标测定

取组织匀浆上清液，测 ＡＣｈＥ 和 ＳＯＤ 活性以及 ＭＤＡ 含量，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。 １．８ 统计学方法 Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫中采用逃避潜伏期（ｓ）和目标象限 距离百分 比（％）为 参 数 评 价 大 鼠 的 学 习 记 忆 能 力。 数据采 用 ＳＰＳＳ１９．０ 软 件 进 行 分 析，计 量 资 料 以 均 值±标准差（ｘ±ｓ）表 示，组间比较采用单因素方差 分析。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２ 结果

通过菌丝体培养，得到羊肚菌干菌丝体总重量为 ２０８．６３ｇ，使用９５％的乙醇提取３次，滤液合并 挥 干 后得到羊肚菌提 取 物 浸 膏 总 重 量 为３７．９５ｇ，提 取 率 为１８．１９％。在定位航行实验（第１～６ｄ）中，随着 训练天数的增加，各组大鼠逃避潜伏期逐 渐 缩 短，提 示各组大 鼠 对 寻 找 水 中 平 台 有 了 一 定 的 记 忆 能 力。 第１、２、３、５和６ｄ时，与空白组比较，模型组的逃避 潜伏期明显延长，提示模型组大鼠的学习记忆能力下 降。第２ｄ时，低、中、高剂量 ＭＥＥ 组逃避潜伏期较 模型组明显缩短（均 Ｐ＜０．０５），提示 ＭＥＥ 对东莨菪 碱所致的 ＡＤ大鼠的学习记忆功能有明显的改善作 用。第２、３、４ｄ时，中剂量 ＭＥＥ组较低剂量 ＭＥＥ组 逃避潜伏期显著延长（均 Ｐ＜０．０５）；而高剂量 ＭＥＥ 组仅在第２ｄ其逃避潜伏期较低剂量 ＭＥＥ组明显延 长（Ｐ＜０．０５），提 示 ＭＥＥ 对 东 莨 菪 碱 所 致 的 ＡＤ 大 鼠学习记忆功能的改善作用无明显剂量依赖关系。

３ 讨论

ＡＤ、帕金森病等常见神经退行性疾病的发病率 高，且有逐年上升趋势，但目前仍缺乏有效的治愈方 法。众多实验和临床研究表明，胆碱能系统在学习和 记忆中具有重要作用，而胆碱能的传递是通过乙酰胆 碱实现的。在生理条件下，胆碱能神经元可以合成大 量乙酰胆碱（ａｃｅｔｙｃｈｏｌｉｎ，ＡＣｈ），而 ＡＣｈ是与 ＡＤ 发生密切相关的重要神经递质，其合成减少、释 放 减 少 或其受体敏 感 性 降 低 均 与 ＡＤ 的 发 生 相 关。研 究 发现，远志寡糖酯可通过降低 ＡＣｈＥ活性对腹腔注射 氢溴酸东莨菪碱所致小鼠记忆功能障碍的胆碱能 神 经系统有一定的恢复作用。另有研究发现，淫羊藿 苷能降低 ＡＤ大鼠海马内 ＡＣｈＥ活性，提高乙酰转移 酶（ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＣｈＡＴ）的表达，增加大脑皮 质 ＡＣｈ含量，从而改善 ＡＤ 大鼠脑内胆碱能神经系 统功能，提示降低 ＡＣｈＥ 的活性可增加 ＡＣｈ的含量 进而改善 ＡＤ 大鼠胆碱 能 神 经 系 统 功 能。本 研 究 通 过行为学实验和 ＡＣｈＥ 活性测定发现，ＭＥＥ 可能通 过降低 ＡＣｈＥ 活性对东莨菪碱所致 ＡＤ 大鼠的空间 学习记忆行为和胆碱功能障碍起到改善作用。