弗劳地枸橼酸杆菌耐药性分析

弗劳地枸橼酸杆菌是一种条件致病的肠杆菌科细菌，天然存在于水、土壤、人与动物的肠道中，常可导致免疫低下者、长期使用广谱抗生素以及侵入性检查患 者的呼吸道、泌尿道、肠道等部位感染，目前是院内感 染的重要致病菌之一。枸橼酸杆菌属对 β － 内酰胺类 抗生素，耐药性严重，其耐药机制主要是产生各种 β － 内酰胺酶，以染色体或质粒编码的AmpC酶较 为常见。

1 材料与方法

1． 1 材料

1． 1． 1 菌株来源

收集 2012 ～ 2017 年安徽省细菌耐 药监测中心每年 9 月收集的监测网内的 34 所医院( 由 14 家三级甲等、4 家三级乙等、16 家二级甲等医院组 成) 报送的 104 株临床分离的弗劳地枸橼酸杆菌。使用全自动细菌鉴定仪重新对全部弗劳地枸橼酸杆菌进 行菌 群 鉴 定。 药敏实验质控菌株大肠埃希菌 ATCC25922、转移接合试验受体菌大肠埃希菌 J53AZＲ 为安徽省细菌耐药监控中心保存菌株。

1． 1． 2 抗生素

氨苄西林( 齐鲁制药有限公司，国药 准字 H37021316) ，头孢哌酮 － 舒巴坦( 美国辉瑞制药 有限公司，国药准字 H20020598) ，哌拉西林 － 他唑巴 坦( 惠氏制药有限公司，国药准字 J20150041) ，头孢吡 肟( 深圳信立泰药业股份有限公司，国 药 准 字 H20041631) ，头孢噻肟和头孢他啶( 华北制药河北华 民 有 限 公 司，国 药 准 字 H13021207 和 国 药 准 字 H20064584) ，头孢曲松( 台湾泛生制药厂股份有限公 司，HC20150030) ，头孢西丁( 山东鲁抗有限公司，国药 准字 H20065080) ，头孢唑肟( 山西天星制药有限公司， 国药准字 H20051649) ，美罗培南( 日本住友制药株式 会社，国药准字 H20100202) ，亚胺培南( 杭州默沙东制 药有限公司，国药准字 J20130123) ，氨曲南( 深圳市海 滨制药有限公司，国药准字 H20103468) ，阿米卡星( 上 海旭东海普药业有限公司，国药准字 H31020590) ，庆 大霉素 ( 上海第一生化药业有限公司，国 药 准 字 H31021994) ，环丙沙星、加替沙星、左氧氟沙星均为药 物标准品，均购自中国食品药品检定研究院。

1． 1． 3 试剂与仪器

Mueller － Hinton ( M － H) 琼脂 购自 英 国 Oxoid 公 司，聚合酶链式反应 ( polynerase chain reaction，PCＲ) 体系( rTaq 酶、10 × PCＲ Buffer、 dNTP Mixture) 及 DNA Marker 标准带均购自大连宝生 物工程有限公司。全自动细菌鉴定仪( 美国 Dade Behring 公司，MicroScanWalkAway － 40) ; 细菌多点接种仪 ( 英国 AQS Manufacturing 公司，A400) ; 电热恒温培养箱( 上海精宏公司，DNP9162) ; PCＲ 仪( 德国 Biometra 公司，070851) ; 凝胶成像系统( 上海天能科技有限公 司，Tanon5200 Multi) ; 低温离心机( 德国 Hettich 公司， UNIVEＲSAL 32Ｒ) ; 电泳仪加电泳槽( 北京市六一仪器 厂，DYCP － 31DN) 。

1． 2 方法

1． 2． 1 抗生素敏感性试验

采用琼脂稀释法对临床分 离弗劳地枸橼酸杆菌和质控菌株大肠埃希菌 ATCC25922 进行多种不同药物的最低抑菌浓度( minimum inhibitory concentration，MIC) 测定。结果解释按照2017 年临床实验 室标准化协会( Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI) 推荐的肠杆菌科 MIC 标准判断。

1． 2． 2 PCＲ 检测

选用 SanPrep 柱式质粒 DNA 小量 抽提试剂盒提取质粒; 中的引物及用多 重 PCＲ 方法扩增质粒介导 AmpC 酶( MOX、CIT、DHA、 ACC、EBC、FOX) 基因; 引物由上海生工生物工程有限 公司合成。PCＲ 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳后，用凝 胶成相系统观察比较，若出现与扩增片段长度相当的 目的条带为阳性。

1． 2． 3 PCＲ 产物序列分析

PCＲ 扩增阳性产物，送 上海生工生物有限公司进行测序分析。应用 GenBank 数据库对测序信息比对分析，以明确 AmpC 酶基因的 基因型别以及是否突变。

1． 2． 4 转移接合试验

PCＲ 扩增 AmpC 酶基因阳性弗 劳地枸橼酸杆菌作为供体菌，大肠埃希菌 J53AZＲ作为 受体菌，描述的方法进行转移接合试验。 在同时含叠氮钠( 200 μg /mL) 和头孢西丁( 16 μg /mL) 的选择性 M － H 琼脂平板上生长的单菌落，即为接合 子。传代 3 次后进行生化鉴定，测定其多种抗生素的 MIC，提取其质粒经 PCＲ 扩增 AmpC 酶基因，并通过测 序比对确认。

2 结果

2． 1 弗劳地枸橼酸杆菌的标本和病区分布

104 株弗劳地枸橼酸杆菌临床分离株，69 株来源于痰标本 ( 66． 3% ) ; 其次为尿液 18 株( 17． 31% ) 、血标本 6 株 ( 5． 77% ) 、分泌物 5 株。科室分布中排名前 3 位的科 室为呼吸内科 32 株( 30． 77% ) 、重症监护病房 25 株 ( 24． 04% ) 、肿瘤内科 12 株( 11． 54% ) 。见表 1、2。

2． 2 药敏结果

104 株弗劳地枸橼酸杆菌对 17 种抗 生素的敏感率及耐药率可以看出，对亚胺培南和美罗 培南最敏感，敏感率高达 98． 08% 。相比于其他三代头 孢类抗生素，四代头孢菌素头孢吡肟以及酶抑制剂复合 制剂如哌拉西林 － 他唑巴坦和头孢哌酮 － 舒巴坦的敏 感性较好，分别可达 74． 04%、79． 81% 及77． 88%。喹诺 酮类及氨基糖苷类敏感性较好，其中左氧氟沙星敏感 性达 65． 38% ，阿米卡星敏感性达80． 77% 。2． 3 PCＲ 扩增结果 以 104 株弗劳地枸橼酸杆菌的 质粒 DNA 为模板，经 PCＲ 检测和 DNA 测序结果显 示: 4 株 AmpC 酶基因阳性，其中3 株为 DHA － 1 基因， 1 株为 ACT － 1 基因。质粒介导的 AmpC 酶基因总阳 性率为 3． 85% ( 4 /104) 。

3 讨论

弗劳地枸橼酸杆菌是革兰阴性肠杆菌科中的兼性 厌氧菌，属于枸橼酸菌属，广泛存在于自然界及医院环 境中，主要见于免疫力功能低下或有基础疾病者，尤其 见于血液系统恶性肿瘤、免疫抑制剂使用、慢性阻塞性 肺部疾病及严重创伤患者中。近几年，弗劳地枸橼酸 杆菌仍然不是临床十分常见分离株，但其发生感染的 频率较以前增加，且感染部位广泛、感染病情严重。 在一个院内机构的大型观察型研究中，枸橼酸杆菌感 染在革兰阴性菌种占 0． 8% ，在肠杆菌科细菌感染中， 占 3% ～ 6%。枸橼酸杆菌感染可以散发也可以是 院内传播。院内枸橼酸杆菌感染的死亡率达 6． 8% ， 而在 其 引 起 的 败 血 症 中 的 死 亡 率 高 达 17． 8% ～ 56%。