对非活动期Graves眼病眼眶脂肪细胞fas/fasL表达的影

Fas( CD95) ，由日本 Yonehara 实验室发现，作为位于细 胞表面重要的死亡受体，是凋亡通路中的信号分子。Fas L( CD178) ，是 fas 的天然配体，fas/fas L 交联形成蛋白复合 体，激活下游多级酶促反应，引起细胞凋亡，研究发现自身 免疫性甲状腺疾病的发病与凋亡信号失调相关。

1 材料与方法

1． 1 药物和试剂

平目汤，由黄芪 30 g，淫羊藿 15 g，川芎 15 g，白芥子 15 g，炙鳖甲 15 g，车前子( 包煎) 30 g 组成，由 上海中医药大学附属龙华医院中药房制备成水煎剂( 生药 含量为 4 g /mL) ，4 ℃保存。 Trizol  Ｒeagent，Life Technologies Corporation 公 司; DEPC( ＲNA 酶抑制剂) ，Sigma － Aldrich － Life Science 公 司; 无水乙醇、75% 乙醇、异丙醇、氯仿、十二烷基硫酸钠 ( SDS) ，国药集团化学试剂有限公司; 逆转录试剂盒( GoScripTM Ｒeverse Transcription System) ，Promega 公司; 台盼蓝 染液、One cell 细胞计数板，上海鲁汶生物科技有限公司; 引物合成，上海闪晶分子生物科技有限公司; Fas 抗体、Fas L 抗体，美国 abcam 公司; GAPDH 单克隆抗体，美国 CST 公 司; 辣根过氧化物酶标记的二抗，美国 Jackson ImmunoＲesearch 公司; 生理盐水，上海长征富民金山制药有限公司; Protein Marker ( PageＲulerTMPlusPrestaind Protein) ，Thermo Fisher Scientific 公司; 蛋白酶抑制剂，Ｒoche Diagnostics 公 司; 微量 BCA 蛋白定量试剂盒，康为世纪公司; 20% SDS solution、Tris － Hcl Buffer( pH 为 6． 8) 、40% 丙烯酰胺( 40% Acr) 、四甲基二乙胺( TEMED) ，BIO － ＲAD 公司; Tris － Hcl Buffer( pH8． 8) ，北京索莱宝( Solarbio) 科技有限公司; SDS － PAGE 上样缓冲液( 5 × ) ，碧云天生物技术研究所; 甘氨 酸( MW75． 07) 、Tween 20，SIGMA － ALDＲICH 公司; 氨基 丁三醇( Tris) ( MW121． 14) ，Sigma 公司; 硝酸纤维素膜 ( PVDF 膜) ，Millipore 公司; 丽春红染色试剂，康为世纪公 司; 脱脂奶粉( 国产伊利牌) ，内蒙古伊利实业集团有限公 司; 显影剂试剂盒( Immobilon Western 化学发光底物) ，Millipore 公司; 胎牛血清，Biowest; DMEM 培养基，上海立菲生 物技术有限公司( life technologise) 。基因序列通过 GenBank 获得，由上海闪晶分子生物科技有限公司设计并合 成。引物序列见表 1。

1． 2 仪器

OLYMPUS － ix71 显微镜，日本 OLYMPUS 公 司; 低温冰箱、制冰机( 型号: SIM － F140) 、高压蒸汽灭菌 器，日本 SANYO 公司; 电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司; SW － CJ 系列洁净工作台，苏净安泰公 司; 低温离心机、Eppendorf ＲT － PCＲ 系统，Eppendorf 公司;数显恒温水槽( 型号: HH － 2) ，国华电器有限公司; SL202N 型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司 ( 批号: 00236) ; BioTek SynergyH4 型酶标仪，Bio － Tek 公司; 纯水 仪，香港 Heal Force 公司; 垂直电泳仪，BIO － ＲAD 公司; 塑 料薄膜封口机( 型号: FS － 200) ，永康市特力包装机械有限 公司; X85 － 2S 恒温磁力搅拌器，上海梅颖浦仪器仪表制造 有限公司; 摇床( TS － 8) ，上海精密仪器制造公司; 全自动数 码凝胶成像系统( G: Box Chemi XT4) ，英国 Syngene 公司。

1． 3 动物和平目汤含药血清的制备

动物: SPF 级雄性 SD 大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号为: SCXK( 沪) 2012 － 0002。实验动物于上海中医药大学实验 动物部 SPF 级动物房进行饲养。

2 结果

与空 白对照组比较，平目汤中剂量组对脂肪细胞 fas mＲNA 的相 对表达量升高( P ＜ 0. 05) ，其余各组则无统计学差异( P ＞ 0. 05) 。与空白对照组比较，平目汤组对脂肪细胞 fas LmＲNA 的相对表达量均升高( P ＜ 0. 05) ，地塞米松组则无 统计学差异( P ＞ 0. 05) 。平目各汤组间比较: 平目汤高剂 量组与平目汤低剂量组比较，差异有统计学意义 ( P ＜ 0. 05) 。见表 2、图 1。

与空白 对照组相比，平目汤各组 fas、fas L 蛋白表达均上调，差异有 统计学意义( P ＜ 0. 05) ，地塞米松组无统计学差异( P ＞ 0. 05) 。在升高 fas 表达方面，平目汤高剂量组与平目汤中 剂量组、平目汤低剂量组比较，差异有统计学意义( P ＜ 0. 05) 。平目汤中剂量组与平目汤低剂量组比较，无统计学 差异( P ＞ 0. 05) 。

3 讨论

Fas/fas L 通路，即死亡受体通路，死亡受体的活化 是诱导细胞凋亡的重要途径之一。fas，相对分子量为 45 kDa，是肿瘤坏死因子/神经生长因子( TNF/NGF) 受体超家 族成员之一，由 325 个氨基酸组成的受体分子，为Ⅰ型跨膜 糖蛋白，胞内段带有特殊的死亡结构域( DD) ，是一种调节 细胞凋亡的膜蛋白。fas L，分子量约为 40kDa，为Ⅱ型跨膜 糖蛋白，同属于肿瘤坏死因子( TNF) 超家族，为 Fas 的天然配体，两者结合可以启动凋亡信号转导，引起细胞死 亡。fas L 是同源三聚体，1 个 fas L 分子可以结合 3 个 fas 分子，三聚化的 fas 分子的 DD 相聚成簇，与带有相同死 亡结构域的连接蛋白 FADD 的 DD( C 端) 结合，形成 fas － FADD 复合体，再由 FADD 的 N 端传递死亡信号，引发级联 反应，致细胞凋亡。Graves 病的甲状腺细胞存在凋亡 现象，研究人员在 Graves 患者甲状腺组织、甲状腺细 胞中发现 fas、fas L 呈高表达。Hara 等研究发现 GD 患者甲状腺功能亢进时，sFas 表达水平升高，当甲状腺 功能恢复正常时，sFas 的表达水平则降低。Koga M 等 选取甲状腺相关性眼病患者的眼外肌组织，发现眼外肌纤 维及间质细胞均存在细胞凋亡，且凋亡程度与眼外肌的增 粗程度呈正相关，进一步发现眼外肌纤维中 fas 显著表达。 通过文献回顾，我们推测 fas/fas L 可能是一个有效防治 GO 的潜在性靶点。