上海精宏分析293T细胞方法的建立！！

目前，将质粒 ＤＮＡ 导入动物细胞的方法有很 多，最常用的方法包括脂质体转染、电转法、显微 注射法和磷酸钙共沉淀法等。虽然脂质体转染方 法已经普遍使用，且具有性质稳定和转染效率高等 优点，但是价格较为昂贵；而磷酸钙转染的方法使 用成本较低，对具体体系加以优化后，能够达到较 好的转染效率，特别是对于２９３Ｔ 细胞来说，与脂 质体的转染效率无明显差异。随着慢病毒感染技 术的进一步发展，各种分子生物学技术及基因技术 的改进，生命科学研究领域越来越多地应用到慢病 毒包装技术，因此，建立起经济高效的２９３Ｔ 细胞 的转 染 方 法 至 关 重 要。１９７３ 年，ＧＲＡＨＡＭ 等首次报道磷酸钙转染法。

１ 材料与方法

１．１ 载体、细胞、主要试剂和仪器

反转录病毒 表达 载 体 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 由 本 实 验 室 构建保存；人胚肾细胞２９３Ｔ 由福建医科大学消化 道 肿 瘤 重 点 实 验 室 提 供；ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、 Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ 培养基和胎牛血清 （美国 Ｇｉｂｃｏ公司）， ＮａＣｌ ［上海国药 （集团）化学试剂有限公司］，葡 萄糖和 ＫＣｌ２ ［中国 医 药 （集 团）上 海 化 学 试 剂 公 司］，ＣａＣｌ２ ·２Ｈ２Ｏ 和 Ｎａ２ＨＰＯ４ ·１２Ｈ２Ｏ ［生 物 工程 （上 海 ） 股 份 有 限 公 司 ］，ＨＥＰＥＳ （台 湾 ＶＷＲ 公 司）， 单 抗 兔 抗 ｆｌａｇ 单 克 隆 抗 体 （１∶ １０００，中 国 ＢＯＳＩＳ 公 司 ）， 单 抗 小 鼠 抗 β－ａｃｔｉｎ （１∶２０００，美国 ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ 公 司）。凝 胶 成 像 系统购于英国Ｓｙｎｇｅｎｅ公司，无菌洁净工作台购于 苏州净 化 设 备 有 限 公 司，ＳＨＰ－１５０型生化培养箱购于上海精宏实验设备有限公司，ＺＥＩＳＳ Ａｘｉｏｃａｍ５１２ 倒 置 荧 光 显 微 镜 购 于 德 国 Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ公司。

１．２ 细 胞 培 养

用 ＤＭＥＭ 培 养 基， 并 添 加 １０％胎 牛血 清，在 ３７℃、５％ＣＯ２ 培养 箱 中 培 养 ２９３Ｔ 细胞。转染 前 １ｄ２９３Ｔ 细 胞 传 代，重 新 种 板，转染前细胞汇合度为４０％～６０％。

１．３ 质粒来源和转染效率的计算

本课题组构建 了 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 质 粒，由 于 质 粒 能 够编码 ＧＦＰ蛋白，该蛋白在荧光显微镜下能够被 激发出绿色荧光，可以作为比较转染效率的计数标 志。荧光显微镜下观察转染２４和４８ｈ后 ２９３Ｔ 细 胞编码绿色荧光蛋白的细胞数目，计算其占相同视 野下总 的 ２９３Ｔ 细 胞 数 目 的 百 分 率，即 为 转 染 效 率。

１．４ 传统磷酸钙转染法转染

２９３Ｔ 细胞 转 染 前 １ｈ换新 鲜 无 血 清 培 养 基，在５ｍＬ 的圆 底 试 管 底 部加入２５μＬ摩尔浓度为 ２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＣａＣｌ２水 溶液 和 ２μｇｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 质粒，加入无菌水 至２２０μＬ，小心 混 匀，且在剧烈吹打下 加入２２０μＬ ＨＥＰＥＳ缓冲 液；圆底试管垂直放在 混旋 器 上 混 旋１０ｓ，室温 静 置３０ｍｉｎ；逐滴 加 入 ２９３Ｔ 细胞，轻轻 晃 动 混 匀；８～１２ｈ 换含 血 清 培 养基，转染２４和４８ｈ后荧光显微镜下观察绿色荧 光。相同方法处理ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ｖｅｃｔｏｒ质粒。

１．５ 改良磷酸

钙 转 染 法 转 染２９３Ｔ 细胞 转 染 前 １ｈ２９３Ｔ 细胞更 换３７℃预热 的 无 血 清 培 养 基，在 １．５ｍＬＥＰ管中加入２２０μＬ无菌水；在水中央加 入 ２μｇｐＣＤＨ－ＧＦＰ－３ｘｆｌａｇ－ＴＲＡＦ６ 质 粒；２５μＬ 摩尔浓度为２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 ＣａＣｌ２水溶液小心地 加到 ＥＰ管的 底 部，沿 管 壁 小 心 逐 滴 加 入２５０μＬ ＨＥＰＥＳ缓冲液至液面；在 ＣａＣｌ２ 与上 层 溶 液 之 间 形成的分层处，用２００μＬ 移液枪轻柔吹打，扰乱 分界；室温放置３０ｍｉｎ；逐滴加入２９３Ｔ 细胞，轻 轻晃动混匀；８～１２ｈ换含血清培养基，２４和４８ｈ 后荧 光 显 微 镜 下 观 察 绿 色 荧 光。相 同 方 法 处 理 ｐＣＤＨ－ＧＦＰ－ｖｅｃｔｏｒ质粒。

２ 结 果

转染２４和４８ｈ后，与传统磷酸钙转染法 （４９．３％± ７．０２％和６４．７％ ±１１．９％）比较，改 良 磷 酸 钙 转 染 法 转 染 效 率 （６９．３％ ±８．０２％ 和 ９４．３％ ± ５．０３％）明 显 升 高 （Ｐ ＜０．０５）。转染２４和４８ｈ后，改良磷酸钙转染 法转染２９３Ｔ 细胞中 ＴＲＡＦ６ｍＲＮＡ 表达水平明显 高于传统磷酸钙转染法 （Ｐ＜０．０１）。转染２４和 ４８ｈ 后，改良磷酸钙转染法转染 ２９３Ｔ 细胞中ｆｌａｇ蛋白表达水平明显高于传统磷酸 钙转染法 （Ｐ＜０．０１）。

３ 讨 论

影响磷酸钙转染法转染效率的因素很多，如试 剂配置的浓度和ｐＨ 值等，因此本研究严格掌 握实验试剂的配置方法，特别是ｐＨ 值的大小和试 剂 的 剂 量 要 求 。转染操作步骤严格按照参考文献和本研究步 骤。操 作 的 不 同 点：

①传 统 法 要求混旋操作步骤，而本研究的操作步骤无混旋；
②本研究操作只要求普通的 ＥＰ管，传统法要求用 圆 底 试 管；
③ ２ 种 方 法 在 质 粒 ＤＮＡ、 Ｈ２Ｏ、 ＨＥＰＥＳ和 ＣａＣｌ２ 的 加 样 方 法 中 存 在 差 别。转 染 ２４和４８ｈ 后荧光显微镜观察显示：传统磷酸钙转 染法转染效率明显低于改良磷酸钙转染法转染效率，表明改良的磷酸钙转染法效率更高。