小鼠血清代谢产物变化分析（精宏烘箱使用）

百草枯（paraquat，PQ）是目前最为广泛的应 用除草剂之一。PQ 对人畜具有非常强的毒性，PQ 急性中毒死亡率高达 50%~80%。PQ 常用于自杀、 投毒，是临床和司法检验中较常见的毒物。百草枯 中毒机制十分复杂，研究发现，除了百草枯本身的 理化作用外，还有大量炎性因子和细胞因子参与作 用。目前 PQ 中毒机制的主流因素为氧化损伤，即活性氧簇（ROS）可直接损伤肺、肾、肝等器官。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂 

气相色谱 7890B（美国安捷伦公司）、质谱仪 PEGASUS HT（美国 LECO 公司）、离心机 Heraeus Fresco 17（美国赛默飞科技公司）、超低温冰箱 Forma 900 series（美国赛默飞科技公司）、超声仪（宁 波新芝科技有限公司）、烘箱、真空干燥仪（上海精宏实验设备公司）。甲醇（色谱纯，CNW 科技公司）、 吡啶（色谱纯，Adamas 试剂公司）、甲氧铵盐（分 析纯，TCI 试剂公司），L-2- 氯苯丙氨酸（≥ 98%， 上海恒柏生物科技）、BSTFA（with 1%TMCS,v/v） （Regis 科技公司）。 

1.2 动物实验 

动物为昆明小鼠（沈阳长生生物技术有限公司 提供）10 只雌鼠，8 周龄，自由饮水、进食，适应 性喂养 1 周。随机分为空白对照组和百草枯中毒模 型组共 2 组，每组 5 只小鼠。取 5 只小鼠，灌胃百 草枯剂量为 30 mg/kg。空白对照组腹腔注射同等剂 量的生理盐水溶液。24h 后处死动物，取心血 0.3 mL，4℃下 15000 r/min 离心 10 min，取上清置于 1.5mLPE 管，置于 -80℃冰箱冻存。 

1.3 GC-MS 样品预处理

取50μL样本于1.5mL EP管中，加入200μL甲醇， 再加入 5μL L-2- 氯苯丙氨酸（溶于超纯水中 0.5mg/ mL），涡旋 30s 混匀；将样本 4℃离心，12000rpm 离心 15min；小心移取 200μL 上清液于 1.5mL EP 管 中；在真空浓缩器中干燥提取物；向干燥后的代谢物 加入 30μL 甲氧胺盐试剂（甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶 20mg/mL），轻轻混匀后，放入烘箱中 80℃孵育 30min；向每个样品中加入 40μL BSTFA（含有 1% TMCS, v/v），将混合物 70℃孵育 1.5h，上机检测。 

1.4 仪器条件 

Agilent7890 GC-TOF-MS，色谱柱 DB-5MS（30 m×250μm×0.25μm），程序升温：初始温度 50℃保 持 1min，以 20℃ /min 的升温速率升至 310℃，保 持 6min。进样口温度 280℃，传输线温度 280℃， 离子源温度 250℃，电离电压 70 ev，质量范围 m/z 50-500 amu，氦气流速为 1ml/min，分流比（1:20） 进样。 

1.5 数据处理 

使 用 ChromaTOF 软 件（V 4.3x，LECO） 对 质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰 积分、峰对齐等分析。对物质定性工作中，使 用了 LECO-Fiehn Rtx5 数据库，包括质谱匹配及 保留时间指数匹配。采用主成分分析（principle component analysis, PCA）观察各组样本之间的 整体分布状况。采用多维分析方法正交偏最小 二乘法判别分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）方法用来评价 模型的准确性，选取变量重要性投影（the variable importance in the projection，VIP）值＞ 1 的差异 代谢物。本研究同时采用学生 t 检验，选定 P ＜ 0.05 为有显著性差异。

2 结果 

2.1 血清代谢组学分析 

PQ 中毒模型组与对照组的血液样本经过硅烷化 衍生、GC-MS 检测，得到 GC-MS 总离子流色谱图， 本次实验共检出 591 个峰。为得到明确的代谢物的差异信息，需要 应用统计学进一步处理数据。 通过对对照组、PQ 中毒组小鼠血清中代谢物 质进行 PCA 分析，发现：PQ 中毒组 与对照组无交叉重叠，具有明显的分离趋势，说 明这两组间小鼠血清代谢物发生了明显的变化。 图 2b 中横坐标 tP 表示第一主成分的预测主成 分得分，纵坐标 tO 表示正交主成分得分，散 点形状和颜色表示不同的实验分组。从 OPLSDA 得分图的结果可以看出，两组样本区分非常 显著，样本全部处于 95% 置信区间（Hotelling’s T-squaredellipse）内。

2.2 潜在生物标志物的确定 

本次实验检出了 591 个峰，采用 OPLS-DA 模 型第一主成分的 VIP（Variable Importance in the Projection）值（阈值＞ 1），并结合学生 t 检验（t-test） 的 p 值（阈值≤ 0.05）来寻找差异性表达代谢物。 本研究将筛选差异代谢物的结果以火山图（volcano plot）的形式进行可视化，PQ 中毒模型对对照组的 结果如图 3 所示，火山图中每个点代表一个代谢物，横坐标代表该组对比各物质的倍数变化（取以 2 为 底的对数），纵坐标表示学生 t 检验的 P 值（取以 10 为底对数的负数），散点大小代表 OPLS-DA 模型 的 VIP 值，散点越大 VIP 值越大，散点颜色代表最 终的筛选结果，显著上调的代谢物以红色表示，显 著下调的代谢物以蓝色表示，非差异性的代谢物为 灰色。

3 讨论 

百草枯中毒后会累及多器官损伤，靶器官是肺 脏，经肺脏摄取百草枯后发生氧化还原反应，会干 扰线粒体电子传递，产生大量氧自由基，诱发脂质过氧化损伤，导致线粒体功能障碍。线粒体是细胞 的“发电厂”，它参与了三羧酸循环和呼吸链的传递。本次研究发现模型组中柠檬酸含量显著增加， 柠檬酸是三羧酸（TCA）循环的中间产物，表明 TCA 循环受阻，底物消耗减少，进而会影响能量供应。总之，PQ 中毒干扰 TCA 循环，表现为柠檬酸、 琥珀酸和富马酸的含量增加。

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