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紫锥菊纯化多糖的制备分析(DHG-9146A使用)

返回列表 来源:未知 发布日期:2019-12-04 09:14【

紫锥菊( Echinacea purpurea,EP) 是多年生草本 植物,属松果菊属植物,因头状花序很像松果而又得 名松果菊,原产于北美,于 19 世纪末被带到欧洲,近 年在我国北京、上海、南京、湖南、山东等地相继引种 成功。紫锥菊具有悠久的药用历史,常用于防治 感冒及上呼吸道感染。紫锥菊提取物含有一系列 不同的化学成分,包括烷基酰胺、咖啡酸衍生物类、苯 丙素类、多糖类和挥发油等,它们具有不同的生物学 效应。

1 材料

1. 1 主要药物与试剂

紫锥菊,采自山东省胶州试验田; 硫酸,购自上海 沃凯生物技术有限公司; 石油醚、二甲苯,均购自天津 市富宇精细化工有限公司; 无水乙醇、氢氧化钠,均购 自莱阳市康德化工有限公司; 氯仿、正丁醇,均购自国药集团化学试剂有限公司,以上试剂均为分析纯。 DEAE-纤维素、Sephadex G-100,均购自北京索莱宝 科技有限公司。

1. 2 试验动物

ICR 小鼠 40 只,体重 18~ 22 g,购自山东朋悦有限 公司,生产许可证: SCXK( 鲁) 20140007,雌雄各半。在 标准实验室条件下饲养: 12 h 光照和 12 h 黑暗交替, 温度为( 22±2) ℃,给小鼠充足的饮食和饮水。

1. 3 主要仪器

电子天平( 型号为 AL204) ,购自梅特勒-托利多 仪器 ( 上 海) 有 限 公 司; 恒温鼓风干燥箱 ( 型 号 为 精宏DHG-9146A) ,购自上海精宏实验用品有限公司; 高 速万能粉碎机( 型号为 FW-100) ,购自北京市永光明 医 疗 仪 器 厂; 紫外可见分光光度计 ( 型 号 为 UV1100) ,购自上海天美科学仪器有限公司; 冷冻干 燥机( 型号为 FD-1D-55) ,购自北京博医康实验仪 器有限公司; 电动耳肿打孔器( 型号为 YLS-25A) ,购 自济南益延科技发展有限公司。

2 方法

2. 1 紫锥菊粗多糖的制备

参照参考的方法并进一步优化。首先 将新鲜的紫锥菊烘干,放入粉碎机中粉碎成 2 cm 左 右后放入圆底烧瓶中,加入石油醚,回流提取 2 h,过 滤,去掉滤液,晒干; 然后取药材加入 15 倍水浸泡至 泡透,80 ℃煎煮 2. 5 h,冷却至室温后过滤; 药渣加入 15 倍水,煎煮 2. 5 h,合并煎煮液,提取液在 80 ℃ 下 浓缩至药液比为 1 ∶ 1,静置,弃去沉淀; 加入 4 倍量 无水乙醇醇沉,边加边搅拌,静置 24 h,抽滤; 沉淀依 次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,冷冻干燥,将冻干后的多糖复溶于水中,配成 1. 5%多糖溶液,将溶液倒入 烧杯中,加入 Sevag( 体积比,正丁醇: 三氯甲烷= 1 ∶ 4) 试剂,溶液与 Sevag 试剂的比例为 3 ∶ 1,搅拌 2 h 后静 置,上层为多糖溶液,中层为蛋白质,下层为 Sevag 试 剂,弃掉中层和下层,在上层多糖溶液中加入新的 Sevag 试剂,重复 8 次,直至去掉所有蛋白质,浓缩去掉 溶液中的有机试剂,将浓缩后的多糖冷冻干燥。

2. 2 紫锥菊纯化多糖的制备

2. 2. 1 紫锥菊多糖 DEAE-纤维素色谱柱的纯化

参照参考的方法并进行适当优化。根据说 明书对 DEAE-纤维素进行前处理,即称取 DEAE-纤 维素 100 g 于烧杯中,加入 10 倍纯化水,搅拌均匀, 浸泡溶胀 24 h,去掉上清 液,装 柱,用 纯 化 水 平 衡 24 h。配 制 浓 度 为 0. 1 mg /mL 的 紫 锥 菊 多 糖, 4 000 r /min离心 10 min,经超滤去除 色 素 后,过 膜 ( 0. 45 μm) 上样,依次用纯化水及 0. 1,0. 3 mol /L NaCl 梯度洗脱,用自动收集器( 流速为 2 mL /min) 每 5 min收集 1 管,共收集 50 管。每管用移液枪吸取 1 mL 收集液于试管中,加入 5%苯酚溶液 1 mL,然后 加入硫酸 5 mL,混匀,静置冷却后用紫外分光光度计 在 490 nm 下测定吸光度。分别合并 3 个吸收峰试管 中的液体,浓缩,透析后冷冻干燥,得到 3 个紫锥菊纯 化多糖( EPPS-1、EPPS-2、EPPS-3) 。

2. 2. 2 紫锥菊多糖葡聚糖凝胶 G-100 色谱柱的纯化

参照参考的方法并进行适当优化。根 据 说 明 书 对 Sephadex G - 100 进 行 处 理,称 取 Sephadex G-100 100 g 于烧杯中,加入适量超纯水, 煮沸 2 h,冷却后装柱,平衡 24 h。将纯化冻干得到的 多糖用纯化水分别配制成浓度为 30 mg /mL 的溶液, 过膜后上样,用纯化水洗脱,流速为 0. 2 mL /min,每 10 min 收集 1 管,共收集 50 管。每管用移液枪吸取 1 mL 收集液于试管中,加入 5%苯酚溶液 1 mL,然后 加入硫酸 5 mL,混匀,静置冷却后用紫外分光光度计 在 490 nm 下测定吸光度。合并收集液,冷冻干燥。

3 结果与分析

与空白对照组比,地塞米松 组、 EPPS-1 组、EPPS-2 组、EPPS-3 组小鼠耳肿胀度均 显著降低( P< 0. 05) ,地塞米松组小鼠耳肿胀度显著 低于 EPPS-1、EPPS-2、EPPS-3 组小鼠的耳肿胀度 ( P<0. 05) 。地塞米松组小鼠的耳肿胀抑制率显著高 于 EPPS-1 组、EPPS-2 组、EPPS-3 组。EPPS-3 组 对小鼠耳肿胀的抑制率显著高于 EPPS-1 组、EPPS- 2 组。说明三种紫锥菊纯化多糖中 EPPS-3 的抑炎 效果最好。EPPS-1、EPPS-2、EPPS-3 组小鼠 的胸腺指数、脾脏指数与空白对照组均没有显著差异 ( P>0. 05) ,地塞米松组小鼠的胸腺指数、脾脏指数均 显著低于空白对照组及 EPPS-1、EPPS-2、EPPS-3 组( P<0. 05) 。

4 讨论与结论

比较了 4 个不同浓度紫锥菊多糖对鸡 脾淋巴细胞的增殖作用,结果表明,紫锥菊多糖具有 明显的免疫增强作用。倪耀娣等研究了紫锥菊多 糖对传染性法氏囊病病毒疫苗免疫雏鸡外周血 T 淋 巴细胞亚群的影响,结果表明,紫锥菊多糖免疫增强 作用较强。C. Steinmüller 等研究了紫锥菊多糖对 环磷酰胺诱导的免疫缺陷小鼠非特异性免疫的影响, 结果表明,紫锥菊多糖具有免疫增强活性。



 


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