GLP-1分泌的相关性研究(精宏水浴锅使用)

２型糖尿病（Ｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｔ２ＤＭ） 是遗传和环境等多种因素联合作用而导致的胰岛素 抵抗（Ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＲ）与胰岛素相对分泌不 足，致使葡萄糖、氨基酸及脂质代谢综合紊乱的一种 全身慢性代谢性疾病。据２０１７年ＪＡＭＡ 发表的研 究文章显示，中国糖尿病患病率为１０．９％，糖尿病 前期约为 ３５．７％。糖尿病患者全球 已 逾１．７亿，其 中２型糖尿病占９０％左右，目前发病率呈逐年上升 趋势，已经成为继心血管疾病和肿瘤之后的第三位主要非传染性疾病。

１ 材料

１．１ 动物

ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪｄｂ／ｄｂ２型糖尿病模型小鼠 ６只，６周龄雄 雌 各 半，其 对 照ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪｄｂ／ｍ 小鼠６只，６周龄雄雌各半（购自江苏南京鹏晟生物科技发展有限公司），饲养于新疆医科大学 ＳＰＦ 级 动 物实验中心。

１．２ 主要试剂

ＱＩＡａｍｐＤＮＡＳｔｏｏｌＭｉｎｉＫｉｔ试 剂盒（德国 Ｑｉａｇｅｎ公司），ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲｋｉｔ（德 国 Ｑｉａｇｅｎ公司），５０ｂｐＭａｒｋｅｒ（北京博迈德科技发展有限公司），溴乙靛（天根生化科技），琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 回收试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）， 胰高血糖素样 肽１（ＧＬＰ－１）、Ｃ 肽（Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ）酶 联 免疫测定试剂盒（上海研辉生物有限公司）。

１．３ 主 要 仪 器

血 糖 仪 （罗 氏 ），凝 胶 成 像 仪 （ＡＩｐｈａＩｍａｇｅｒＨＰ），电 泳 仪、全 自 动 酶 标 仪、ＰＣＲ 扩增仪、实时荧光定量仪（美国 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），低速 大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂），电热恒 温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司），组织匀浆仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），厌 氧 罐 及 厌 氧 袋 （日本三菱）。

２ 方法

２．１ 样本采集及处理

２．１．１ 动物分组及粪样的收集

６周龄ｄｂ／ｄｂ２型 糖尿病模型小鼠和对照组ｄｂ／ｍ 小鼠适应性饲养１ 周后，开始监测小 鼠（７－１２周）的 体 质 量 和 空 腹 血 糖（ＦＢＧ），收集每天下午４∶００－５∶００的新鲜粪样 于冻存管中密封，迅速液氮冷冻后放入厌氧袋中，转 存至－８０℃冰箱保存备用。

２．１．２ 血样

实验终末期用乙醚将小鼠麻醉后剖开腹部，收集门脉血及腹 主 静 脉 血，３０００ｒ／ｍｉｎ离 心１５ｍｉｎ后分离血清，迅速放入液氮冷冻后，转存 至－８０℃冰箱保存备用。 ２．１．３ 组织 小鼠处死后，收集结肠部位的内容物 及结肠组织，迅速液氮冷冻后，转存至－８０℃冰箱保 存备用。

２．２ 肠道多形拟杆菌、史氏产甲烷短杆菌的检测

２．２．１ 结 肠 内 容 物 和 粪 样 肠 道 微 生 物 总 ＤＮＡ 提 取

按照 ＱＩＡａｍｐＤＮＡＳｔｏｏｌＭｉｎｉＫｉｔ试剂盒（德 国 Ｑｉａｇｅｎ公司）的使用说明提取结肠内容物和粪样 中的细菌总 ＤＮＡ。

２．２．２ 总 ＤＮＡ 浓度测定及纯度鉴定

以 ＴＥ 对照 液，取２μＬＤＮＡ 样品，ＤａｎｏＤｒｏｐ１０００测定总 ＤＮＡ 在２６０ｎｍ 和 ２８０ｎｍ 处 的 吸 光 度。 取 ５μＬ 总 ＤＮＡ 和２μＬｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ电泳经１％琼脂糖凝胶电泳，８０Ｖ 电 压４０ ｍｉｎ，凝 胶 成 像 仪 照 像，检 测 总 ＤＮＡ 的纯度与完整性。

２．２．３ 多形拟 杆 菌、史 氏 产 甲 烷 短 杆 菌

１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６区 ＰＣＲ扩增 在１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６可变序列区进 行细菌特异性引物的设计，用于引导１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６ 可变区的 ＰＣＲ扩增反应，序列见表１。

２．２．３．１ 普 通 ＰＣＲ 体系和反应程序

反 应 体 系 （２０μＬ）：２×ＰＣＲ ｍｉｘ１０μＬ，上、下游引物（表１）各 ０．５ μＬ，细 菌 总 ＤＮＡ ２ μＬ，Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅ ７μＬ。反应 程 序：预 变 性 ９５℃、３ ｍｉｎ；变 性 ９５℃、 ３０ｓ，退火（表１）、３０ｓ，延伸７２℃、１ｍｉｎ，共３９个循 环；终延伸７２℃、５ｍｉｎ，４℃保持。

２．２．３．２ ＰＣＲ产物鉴定

ＰＣＲ产物经２．５％琼脂糖 凝胶电泳，８０ Ｖ 电 压 ４０ ｍｉｎ，凝胶成像仪下观察 结果。

２．２．３．３ 多形拟杆菌、史氏产甲烷短杆菌

ＲＴ－ｑＰＣＲ 检测

２．２．３．３．１ 标准曲线的建立

将多形拟杆菌、史氏 产甲烷 短 杆 菌 的 ＰＣＲ 产 物 经 切 胶、回 收 后 作 为 ＤＮＡ 标准品，将 标 准 品 稀 释 为 浓 度 梯 度 为 １０１ ～ １０８ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的 ＤＮＡ 样本作为阳性模板，同 时 以 Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ为阴性 对 照，每 个 样 平 行 重 复 ３次，反应体系（２０μＬ）：上、下游引物各０．５μＬ，荧 光染料（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ）１０μＬ，ＤＮＡ 模板２μＬ，Ｎｕ－ ｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ７μＬ，反 应 程 序：预 变 性 ９５℃、 ２ｍｉｎ，变性９５℃、５ｓ，退火（表１）、３０ｓ，３５个循环。 由实时荧光定量 ＰＣＲ仪自动绘制扩增曲线、熔链曲 线，产 物 通 过 熔 链 曲 线 证 实。反 应 结 束 后 用 ＰＣＲ 仪附带软件分析，自动生成标准曲线。

２．２．３．３．２ 小鼠粪样及结肠内容物多形拟杆菌、史 氏产甲烷短杆菌的检测

按上述“２．２．３．３．１”中的反 应体系和程序进行实时荧光定量 ＰＣＲ反应，检测小 鼠粪样及结肠内容物中的多形拟杆菌、史氏产甲烷 短杆菌。 ２．３ ＧＬＰ－１的检测 酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）检 测 门 脉血、结肠匀 浆 液 中 ＧＬＰ－１的 含 量：按 照 试 剂 盒 的 使用说明进行操作。

２．４ 检 测 空 腹 Ｃ 肽 水 平

计算胰岛素抵抗指数 （ＨＯＭＡ－ＩＲ）、分 泌 指 数（ＨＯＭＡ－ＩＳ） 空 腹 Ｃ 肽 采 用 ＥＬＩＳＡ 法检 测，按照试剂盒的使用说明进行操 作。用空腹 Ｃ肽代替胰岛素采用改良 ＨＯＭＡ（ＣＰ） 公式评价胰岛素抵抗和胰岛素的分泌指数。

３ 结果

结肠内容物中史氏产甲烷短杆菌 ＲＴ－ＰＣＲ 结 果显示：与对照ｄｂ／ｍ 组小鼠相比，ｄｂ／ｄｂ组小鼠结 肠内容物史氏产甲烷短杆菌数量增加，差异有统计 学意义 （Ｐ ＜０．０５）。Ｐｅａｒｓｏｎ相 关 性 分 析 显 示，肠 道 史 氏产甲烷短杆菌的数量与小鼠体质量 （ｒ＝０．５９，Ｐ ＜０．０１）、空腹血 糖（ｒ＝０．５０，Ｐ ＜０．０１）呈 正 性 相 关，见图１１；与小鼠空腹Ｃ肽水平 （ｒ＝－０．４４，Ｐ ＜０．０１）、胰岛分泌指数（ｒ＝－０．３９，Ｐ ＜０．０１）呈负性 相关，与胰岛素抵抗指数（ｒ＝０．４９，Ｐ ＜０．０１）呈正 性相关。

４ 讨论

近期越来越多的研究表明肠道微生态与２型糖 尿病的发 生、发 展 密 切 相 关。Ｎａｄｊａ等通 过 与 正 常青年人群相比，２型糖尿病青年人群肠道中的 多 形拟杆菌门／厚壁菌门比例较高，多形拟杆菌与血糖 呈正相关。Ｏｌｌｉ等的研究证实大量的肠道拟杆 菌可以影响实验大鼠体质量。这种作用可能是通过 改变肠道微生物群的组成或通过微生物代谢物介导的。



 

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