精宏生化培养箱使用于棉铃疫病生防细菌的分析

棉花烂铃病是一类由真菌或细菌引起的棉铃病 害，包括疫病、红腐病、炭疽病、黑果病、红粉病、角斑 病、软腐病、曲霉病、灰霉病和黑斑病等10余种（过 崇俭和罗张，1963；棉花铃病联合调查组，1986）。棉 铃疫病是我国各主要产棉区棉花铃期的主要病害， 其发病率和危害性居各种烂铃病之首（沈其益， 1992；李社增等，2017），严重影响棉花的产量和 品质。

供试病原菌、菌株和植物：棉铃疫病病原菌菌株 JP5-1，自河北省沧州市献县河城街镇河城街村罹病 棉铃上分离，在棉铃上表现为强致病力，由河北省农 林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室 保存。在河北省邯郸市、邢台市棉田，辛集市玉米 田，定兴县番茄田和保定市黄瓜田分别采集作物根 围土壤，采用常规系列稀释法共分离纯化获得1 250株 供试细菌菌株。采用实验室通用编号规则对其进行 编 号 并 于 - 80℃ 保 存 ，其 中 菌 株 HMB13496~ HMB13542、HMB15830~HMB15869、HMB20800~ HMB20868 和 HMB21265~HMB21493 共 385 株，自 棉花根围土壤分离；菌株HMB21962~HMB22278和 HMB22870~HMB22926 共 374 株，自玉米根围土壤 分离；菌株 HMB23318~HMB23448 和 HMB23606~ HMB23784 共 310 株，自番茄根围土壤分离；菌株 HMB23807~HMB23987 共 181 株，自黄瓜根围土壤 分离。在棉花盛铃期，从河北省保定市高阳县邢家 南镇北于八村试验棉田采集带柄、健康、直径约2.5 cm 的成铃，备用。棉花品种为农大棉8号。 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：20% 土豆煎汁、2% 葡萄糖、2% 琼脂粉、蒸馏水1 000 mL；LB（Luria-Bertani）固体培 养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、1% NaCl、2%琼脂 粉、蒸馏水1 000 mL；LB液体培养基：1%胰蛋白胨、 0.5%酵母粉、1% NaCl、蒸馏水1 000 mL。 药剂、试剂及仪器：80%三乙膦酸铝（phosethylAl）可湿性粉剂，浙江嘉华化工有限公司。细菌基因 组 DNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公 司；PCR扩增试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒， 宝生物工程（大连）有限公司；rTaq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mix ，宝生物工程（大连）有限公司；自制 的结晶紫染色液，将结晶紫2 g溶于20 mL 95%乙醇 中，取20 mL与1%草酸铵水溶液80 mL混匀置24 h 后过滤；其它试剂均为国产分析纯。BX63F正置荧 光显微镜，日本Olympus公司；2720型PCR仪，德国 Biometra 公司；DYY-6C 电泳仪，北京六一仪器厂； GEN III-Omnilog型Biolog微生物自动鉴定系统，美 国 Biolog 公司；上海精宏SHP-080生化培养箱；ZQZY-80BS振荡培养箱， 上海知楚仪器有限公司；VD-650-U洁净工作台，苏 州安泰空气技术有限公司。

采用平板对峙法（李社增等，2005b）测定1 250株 供试菌株对苎麻疫霉的拮抗作用。将4℃下保存的 苎麻疫霉转接到PDA平板上，于25℃下培养3 d，在 苎麻疫霉菌落边缘用直径 6 mm 打孔器打取菌饼， 将苎麻疫霉菌饼转接到另一个PDA平板中央，将活 化后的供试细菌菌株在距苎麻疫霉菌饼 20 mm 处 点接接种，以不接种任何供试细菌菌株的苎麻疫霉 为空白对照。25℃恒温培养5 d后，测量苎麻疫霉正 常生长半径、抑制生长半径和抑菌带，计算抑菌率， 抑菌率=（正常生长半径-抑制生长半径）/正常生长 半径×100%。以抑菌带和抑菌率为指标初步筛选对 苎麻疫霉有较好拮抗作用的供试菌株。 将-80℃下保存的苎麻疫霉拮抗菌菌株转接到 LB固体培养基试管斜面上活化，24 h后挑取单菌落 接入装有 100 mL LB 液体培养基的 250 mL 三角瓶 中，在振荡培养箱中于 170 r/min、30℃条件下培养 48 h，用 LB 固体平板培养基检测培养液中菌体数 量，用无菌 0.9% 生理盐水将其调配成浓度为 1.0× 107 CFU/mL的细菌培养液。

称取1 g 80%三乙膦酸铝可湿性粉剂，放入1 L 的玻璃量杯中，加入100 mL无菌水，玻璃棒搅拌使 之溶解，再加入400 mL无菌水即配制成80%三乙膦 酸铝可湿性粉剂500倍药液。 对初步筛选的供试菌株进行室内筛选。采用离 体棉铃人工接种病原菌。将田间采集的健康带柄棉 铃用75%酒精进行表面灭菌，并将棉铃固定在长40 cm、 宽25 cm的长方形白色泡沫板上，室温下晾干。每 块泡沫板平均分为8列，每列平均固定5个棉铃，共 40个棉铃，每2 列的10个棉铃为1个处理的1次重 复。在每个棉铃表面喷施浓度为 1.0×107 CFU/mL 供试拮抗细菌培养液1 mL，以每个棉铃喷施80%三 乙膦酸铝可湿性粉剂500倍药液1 mL为化学药剂对 照，喷施等量蒸馏水为空白对照，喷施不同处理药剂 时用挡板将其它棉铃隔开，保证药液喷施在10个目 的棉铃表面，每个处理重复4次。将固定有40个棉 铃的泡沫板放入盛有 300 mL 无菌水、长´宽´高为 42.0 cm´27.5 cm´10.5 cm 的保湿培养盒内，用保鲜 膜封严保湿，置于25℃人工气候室恒温培养。24 h 后打开保湿培养盒，在每个棉铃铃缝中上部用消毒 针刺 3 个小孔，深度 3 mm，将在 PDA 培养基上于 25℃培养5 d的苎麻疫霉菌落用打孔器打取直径为6 mm的菌饼，贴接在棉铃铃缝针孔处，继续保湿培养。

1 250 株作物根围细菌中共筛选到 399 株对 苎麻疫霉有较好拮抗作用的供试菌株，其中抑菌带大于等于 9.0 mm 的菌株有 40 株，抑菌带大于等于 10.0 mm 的 菌 株 有 11 株 ，抑 菌 率 达 到 80.00%~ 85.71%，其中菌株 HMB22922 对苎麻疫霉抑 菌率最高，为85.71%，抑菌带宽10.0 mm。对初步筛选的 11 株供试菌株进行室内筛选。 人工接种病原菌后，棉铃疫病发病迅速，其中10株 供试菌株对棉铃疫病表现一定的防治效果。 接种后5 d时，空白对照的病情指数达到14.38，喷施 菌株HMB22922、菌株HMB23917、菌株HMB21405 细菌培养液棉铃的病情指数和化学药剂之间差异不 显著，但均显著低于空白对照（P<0.05），防治效果分别达到 73.92%、69.58%、56.54% 和 70.72%；喷施其 它7株菌株细菌培养液棉铃的病情指数与空白对照 之间差异不显著。接种7 d后，空白对照病情指数为46.88，喷施菌 株HMB22922、菌株HMB21405、菌株HMB23917细 菌培养液棉铃的病情指数和化学对照药剂之间差异 仍然不显著，但均显著低于空白对照（P<0.05），对棉 铃疫病的防治效果分别为 81.34%、66.67%、64.60% 和 71.11%；喷施菌株 HMB23319、菌株 HMB22277、 菌株 HMB20802 和菌株 HMB23707 细菌培养液棉 铃的病情指数显著低于空白对照（P<0.05），对棉铃 疫病的防治效果在34.67%~49.34%之间；喷施菌株 HMB20803、菌株 HMB20826 和菌株 HMB23663 细 菌培养液棉铃的病情指数与空白对照之间差异不显 著，对棉铃疫病的防治效果在20.01%~29.34%之间。

拮抗作用是生防细菌发挥生物防治效果的主要 机制之一，通过拮抗活性测定初步筛选生防细菌是 目前最普遍的方法（张斌等，2015）。由于棉铃疫病 的主要病原菌苎麻疫霉可以离体培养，本研究采用 对峙培养法进行棉铃疫病生防细菌的初步筛选，共获得11株拮抗活性较强的拮抗细菌。然而众多研 究表明，离体拮抗活性较强的细菌在田间未必表现 出较好的生物防治效果（刘邮洲等，2012），因为有些 细菌抑菌物质的产生受培养条件的影响，在PDA培 养基上可以产生的抑菌物质，但在棉铃上未必产生 或产生的浓度不足以抑制病原菌。另外，防治效果较好的生防细菌往往是多个生防作用机理综合表现 的结果，包括抑菌作用（Kumar et al.，2011）、竞争作 用（Yánez-Mendizábal et al.，2012）以及诱导植物抗 病性（Kloepper et al.，2004；Lahlali et al.，2013）等。 本研究针对初步筛选的11株拮抗细菌进行了离体 防治效果和田间防治效果评价，发现只有拮抗细菌 HMB22922在田间表现出较好的防治效果。本研究 已明确 HMB22922 菌株对苎麻疫霉有很好的抑菌 作用，该菌株对苎麻疫霉是否产生竞争作用，对棉花 植株是否产生诱导抗性作用仍需深入研究。

免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。