生化培养箱使用于次级代谢产物生物活性研究

阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）又称遗忘型痴呆症，是一种神经系统退行性疾病，严重影响患 者的认知、记忆以及社会生活能力 ．ＡＤ的发病机制一直是研究者密切关注的问题，其中主要涉及胆碱能 功能障碍、Ａβ淀粉样蛋 白、氧化应激及自由基损伤等 ．目 前 临 床 治 疗 ＡＤ 主 要 采 用 以 乙 酰 胆 碱 酯 酶 （ＡＣｈＥ）为药物靶点的乙酰胆碱酯酶抑制剂（ＡＣｈＥｌｓ）；另有研究指出，氧化应激可能会增加自由基的水平， 从而导致 Ａβ淀粉样蛋白升高，因此清除细胞内过剩的自由基或成为治疗 ＡＤ的新方向．

在日照海域采集野生牡蛎，通过分离纯化得到共生细菌．

（ｇ／１００ｍＬ）．ＬＢ液体培养基：胰蛋白胨１ｇ，酵母浸粉０．５ｇ，过滤灭菌海水１００ｍＬ，ＰＨ 自 然；ＬＢ固体培养基：ＬＢ液体培养基 ＋１．６ ％ 琼脂粉．

恒温振荡培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），恒温生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司），ＰＣＲ仪（美国ＢＩＯ－ＲＡＤ），多功能检测仪（美国Ｂｉｏｔｅｋ公司），旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限 公司）；细菌基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒、ＰＣＲ扩增等试剂均购自天根生化科技有限公司，碘代硫代乙酰胆碱（ＡＴＣＩ）、乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）及 ＤＴＮＢ，１，１－ 二苯基 －２－ 三硝基苯肼（１－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ） 等试剂均购自上海源叶生物科技有限公司．

将新鲜野生牡蛎于７５％ 酒精中浸泡３０－６０ｓ，无菌海水润洗３次，称取１０ ｇ牡蛎肉于１００ｍＬ灭菌海水中浸泡，１６０ｒ獉ｍｉｎ－１ 振荡４５ｍｉｎ，匀浆，过滤得牡蛎菌悬液．无菌条件下从菌悬 液中吸取１０μＬ至三角瓶中，灭菌海水补足至５００ｍＬ，得到１０－１ 的菌液，然后梯度稀释分别得到１０－２、１０－３、 １０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９ 菌液．吸取１００μＬ上述各浓度菌液均匀涂布于ＬＢ固体培养基上，置于３７℃ 恒温培养箱中，定期观察，分离纯化得到单一菌落．

参照文献提取已分离纯化菌株的ＤＮＡ，以２７Ｆ／１４９２Ｒ为引物进行ＰＣＲ扩 增，ＰＣＲ反应条件为：预变性９５℃３ｍｉｎ→ 变性９５℃４５ｓ→ 退火５５℃４５ｓ→ 延伸７２℃５０ｓ→ 充分延伸 ７２℃１０ｍｉｎ→ 保存１６℃２ｍｉｎ→ 循环扩增３５次，取５μＬＰＣＲ产物进行琼脂糖凝胶电泳，其余送苏州金 唯智生物科技有限公司测序．

将分离出的菌株接种至 ＬＢ液体培养基中，恒温振荡培养 （３６ｈ，３７ ℃，１６０ｒ獉ｍｉｎ－１）．离心发酵液（６５００ｒ獉ｍｉｎ－１，２５ｍｉｎ）取上清，２倍体积乙酸乙酯萃取３次，合并 乙酸乙酯层，浓缩得粗浸膏，将上述粗浸膏溶于 ＤＭＳＯ，配置成５ｍｇ·ｍＬ－１ 溶液备用．

参照文献采用改良 Ｅｌｌｍａｎ法测定其对 ＡＣｈＥ 的抑制活性．磷酸缓冲溶液（０．１ ｍｏｌ獉Ｌ－１，ＰＨ＝８．０），ＡＣｈＥ（０．０５Ｕ獉ｍＬ－１），ＤＴＮＢ（０．０６６７ｍｏｌ獉Ｌ－１），ＡＴＣＩ（０．１ｍｍｏｌ獉Ｌ－１）．取４支５ ｍＬＥＰ管，设置空白（Ａ１）、标准（Ａ２），样品本底（Ａ３），样品（Ａ４）组．分别加入磷酸缓冲溶液２９５０μＬ、２８８０ μＬ、２９５０μＬ和２８８０μＬ；Ａ１ 和Ａ２ 组中分别加入ＤＭＳＯ１００μＬ；Ａ３ 和Ａ４ 组中加入１００μＬ的待测样品溶液； Ａ２ 和Ａ４ 组加入７０μＬ的ＡＣｈＥ溶液．充分混匀，冷藏２０ｍｉｎ后，分别加入１００μＬ的ＤＮＴＢ和２０μＬ的ＡＴＣＩ 溶液，得到最终的反应体系．３７ ℃ 水浴反应２５ｍｉｎ后，加终止剂０．４％ ＳＤＳ（１００μＬ）．本实验以盐酸他克林 （Ｃｏｇｎｅｘ）作为阳性对照．在４１２ｎｍ 处测得 ＯＤ值，按公式计算出抑制率 抑制率（％）＝ （Ａ２ －Ａ１）－ （Ａ４ －Ａ３） Ａ２ －Ａ１ ×１００％．

参照文献方法，采用ＤＰＰＨ自由基清除法测定牡蛎内生细菌次级代谢产物的 抗 氧化活性．以７５％ 乙醇作为参比溶液调零，空白组（Ａ０）中加入７５％ 乙醇１００μＬ，ＤＰＰＨ 溶液（０．４ｍｍｏｌ ·Ｌ－１）１００μＬ；样品组（Ａｉ）中加入待测样品２μＬ，７５％ 乙醇９８μＬ，ＤＰＰＨ 溶液１００μＬ；样品本底组（Ａ１）中 加入待测样品２μＬ，７５％ 乙醇１９８μＬ，以抗坏血酸（Ｖｃ）为阳性对照．室温暗置３０ｍｉｎ后，在最大波长为５１７ ｎｍ 测 ＯＤ值，按照公式计算清除率 清除率（％）＝ Ａ０ － （Ａｉ －Ａ１） Ａ０ ×１００％．

菌株部分生理生化等特性参照《常见细菌系统鉴定手册》 进行．

通过对牡蛎共生细菌进行分离纯化、培养，共得到并鉴定出牡蛎共生细菌６２株．采用通用引物２７Ｆ和 １４９２Ｒ进 行 ＰＣＲ 扩 增，经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳，基 因 测 序 结 果 经 Ｂｌａｓｔｎ 比 对，结 果 表 明，ＨＹＭＬ－１－６、 ＨＹＭＬ－１－２５、ＨＹＭＬ－１－３４ 和 ＨＹＭＬ－１－４４ 菌 株 为 孤 菌 属；ＨＹＭＬ－１－１１、ＨＹＭＬ－１－２２、ＨＹＭＬ－１－２７、 ＨＹＭＬ－１－３７、ＨＹＭＬ－１－３８ 和 ＨＹＭＬ－１－４０ 菌 株 为 芽 孢 杆 菌 属；ＨＹＭＬ－１－４、ＨＹＭＬ－１－１２、ＨＹＭＬ－１－１９、 ＨＹＭＬ－１－３１菌株为运动鲁杰 氏 菌；ＨＹＭＬ－１－１５、ＨＹＭＬ－１－１６、ＨＹＭＬ－１－４６ 菌 株 为 黄 杆 菌；ＨＹＭＬ－１－１４、 ＨＹＭＬ－１－２０、ＨＹＭＬ－１－５２菌株为交替单胞菌；ＨＹＭＬ－１－４７菌株为嗜热脂肪芽孢杆菌；其余４１株菌株为交 替假单胞菌属，因此，假单胞菌属为牡蛎共生细菌中优势菌属．部分菌株１６ＳｒＲＮＡ 基因序列比对分析结果 如表１所示．

ＡＣｈＥ活性筛选 对牡蛎内生细菌的次级代谢产物进行抑制 ＡＣｈＥ活性筛选，结果如图１所示，有１３株细菌的次级代谢产物 粗提物（５μｇ·ｍＬ－１）对 ＡＣｈＥ具有一定的抑制活性，分别为 ＨＹＭＬ－１－３，ＨＹＭＬ－１－６，ＨＹＭＬ－１－９，ＨＹＭＬ－１－１０， ＨＹＭＬ－１－１１，ＨＹＭＬ－１－１２，ＨＹＭＬ－１－１８，ＨＹＭＬ－１－２４，ＨＹＭＬ－１－２６，ＨＹＭＬ－１－２７，ＨＹＭＬ－１－３９，ＨＹＭＬ－１－４７， ＨＹＭＬ－１－６２．其中，ＨＹＭＬ－１－１１和 ＨＹＭＬ－１－６２菌株次级代谢产物的活性较强，抑制ＡＣｈＥ活性ＩＣ５０ 分别为５．０１和４．５３μｇ·ｍＬ－１． 

海洋资源因其特殊的环境，在长期的进化过程中产生一系列独特的次级代谢产物，这些次级代谢产物具有化学结构新颖和生物活性多样的特点，因此海洋资源是产生新型生物活性物质的宝库 ．研究表明，从 海绵、藻类和海鞘等分离出的海洋细菌Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓ．ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｓ．ｐａｃｉｆｉｃａ 等，其次级代谢具有抗癌、 抗菌、抗炎、抗疟等作用，其中一些已应用于临床，如环孢菌素Ａ、利福霉素、环马林素Ｄ等 ．此外，海洋微 生物中芽孢杆菌属的成员其次生代谢产物表现出多种独特的结构和生物活性 ．王凤舞等从青岛海域牡 蛎中分离得到８株内生细菌，然而仅一株细菌的次级代谢产物具有乙酰胆碱脂酶抑制活性，本研究从日照海 域野生牡蛎中分离纯化得到６２株内生细菌，对其进行分子生物学鉴定，结果显示，其中４株为孤菌属，６株为 芽孢杆菌属，４株为鲁杰式菌属，３株为黄杆菌属，３株为交替单胞菌属，１株为嗜热脂肪芽孢杆菌，其余４１株 为交替假单胞菌属，因此，交替假单胞菌属为牡蛎内生细菌中优势菌属．抑制 ＡＣｈＥ 活性和抗氧化活性研究 结果表明，１３株菌株具有一定的抑制 ＡＣｈＥ活性；２２株菌株显示较强的ＤＰＰＨ 自由基的清除作用．此外还发 现，具有 ＡＣｈＥ抑制作用的１３株菌株的次级代谢产物均显示较强的抗氧化活性，揭示其次级代谢产物中含 有潜在的活性物质，有望为治疗以胆碱能缺乏及自由基过剩为特征疾病的先导化合物的开发提供一定的理 论依据。