上海精宏解析杀菌剂的敏感性及菌株保存条件

由米根霉 Rhizopus oryzae Went et Pr. Geerl.引 起的烟叶霉烂病 (tobacco pole rot) 是烟草烘烤期较 易出现的真菌性病害，主要发生于烟叶变黄 期，通常在茎基部出现白色菌丝，很快产生黑色 孢子并进一步扩散为害。在烟叶烘烤过程中，密 集烤房由于空间小、温度高、湿度大以及空气流 动快，尤其有利于该病害的发生与流行。烟叶霉 烂病具有爆发性和危害性强的特点，严重时发病 率高达 100%，常导致烤后烟叶质量下降、产量降 低，烟农利益受损。

米根霉 Rhizopus oryzae 菌 株 Y5 (CCTCC M 2015720)，贵州省烟草科学研究 院微生物实验室提供，采用真菌培养基 (AEA) (酵母粉 5 g/L，KH2PO4 6 g/L，NaNO3 6 g/L，KCl 0.50 g/L，MgSO4 0.25 g/L，甘油 20 mL/L，琼脂 粉 20 g/L，加去离子水定容至 1 L，灭菌待用) 培 养，于 4 ℃ 下、AEA 培养基斜面上保存。

烟草品种为云烟 87，属烟草主 栽品种，易感病。于烟叶成熟季节采集未施用过 任何药剂的中部成熟叶片，洗净、晾干后用于活 体防效测定。

85% 代森锰锌 (mancozeb)，杜邦 中国集团有限公司；80% 多菌灵 (carbendazim)， 江苏蓝丰生物化工股份有限公司；96% 嘧霉胺 (pyrimethanil)，江苏耕耘化工有限公司；98% 嘧 菌酯 (azoxystrobin)，湖北津乐达化工有限公司； 99.90% 啶酰菌胺 (boscalid)，Sigma-Aldrich 有限公 司；96% 氟啶胺 (fluazinam)，淄博德樽生物科技有 限公司。除代森锰锌用无菌水、多菌灵用 0.20 mol/L 的稀盐酸配制外，其余药剂均溶于甲醇中，分别 配成 1.0 × 104 mg/L 的母液，于 4 ℃ 黑暗条件下保 存，备用。试验时将上述药剂母液加至无菌水 中，制成系列质量浓度的药液，其中盐酸或甲醇 的体积分数均小于 0.25% (此浓度的盐酸或甲醇均 不影响烟草米根霉孢子的萌发)。以在空白无菌水 中加入相同体积分数稀盐酸或甲醇的处理作为空 白对照。

85% 代森锰锌可湿性粉剂 (WP)， 杜邦中国集团有限公司；50% 多菌灵 WP，江苏 蓝丰生物化工股份有限公司；40% 嘧霉胺 WP， 北京中农绿洲生物科技有限公司；250 g/L 嘧菌酯 悬浮剂 (SC，阿米西达)，先正达 (中国) 投资有限 公司；50% 啶酰菌胺水分散粒剂 (WDG，凯泽)，巴斯夫 (中国) 投资有限公司；500 g/L 氟啶胺悬浮 剂 (SC，福帅得)，日本石原产业株式会社。

采用孢子萌 发法测定。将米根霉菌株在 AEA 培养基上培养 5 d 后，菌丝表面产生大量黑色孢子，向培养皿中 加入 10 mL 无菌水，用无菌纱布过滤并收集孢 子，制得每毫升含 1 × 106 个孢子的悬浮液。分别 吸取 50 mL 各浓度药液，与 50 mL 孢子悬浮液混 合，制得孢子混合液；以相同体积的无菌水和孢 子悬浮液混合后作为空白对照。孢子混合液中代 森锰锌的最终测定质量浓度为 0、3.13、6.25、 12.5、25 和 50 mg/L；多菌灵和嘧霉胺均为 0、 12.5、25、50 和 100 mg/L；嘧菌酯为 0、3.13、 6.25、12.5、25 和 50 mg/L；啶酰菌胺和氟啶胺均 为 0、0.13、0.25、0.50、1 和 2 mg/L。分别吸取 20 μL 孢子混合液至载玻片上，于保湿培养皿中、 30 ℃、黑暗条件下培养，每处理 3 次重复。12 h 后随机镜检孢子的萌发情况，当萌发芽管长度超 过孢子半径时视为萌发，计算各杀菌剂各浓度处 理对病原菌孢子萌发的抑制率。

将米根 霉菌株在 AEA 平板上培养 5 d 后，在菌落边缘打 取直径 5 mm 的菌碟。采用无菌水配制系列质量 浓度的各制剂药液，其中，代森锰锌最终质量浓 度 (有效成分) 分别为 0、160、800 和 4 000 mg/L， 多菌灵和嘧霉胺为 0、50、200 和 800 mg/L，嘧菌 酯为 0、12.5、50 和 250 mg/L，啶酰菌胺为 0、 37.5、125 和 200 mg/L，氟啶胺为 0、200、500 和 1 000 mg/L。采用手动喷雾器 (1.5 L，浙江涛桲 喷雾器有限公司) 向离体叶片正面均匀喷雾各浓度 药液，直至药液开始滴落，对照喷施同体积的无 菌水。施药 24 h 后，用接种针在叶片主脉同一部 位制造相同尺寸伤口，接种直径 5 mm 的菌碟， 每处理 6 片烟叶，3 次重复。接菌后用脱脂棉包裹 叶片茎基部保湿，置于 37 ℃、相对湿度大于 95% 的恒温恒湿培养箱（上海精宏实验设备有限公司）中培养，48 h 后测量叶脉病斑长度，计 算各杀菌剂各浓度处理对烟叶霉烂病的防效。

按 1.2.1 节 方法制备每毫升含 1 × 106 个孢子的悬浮液，分别 采用以下方法进行保存：1) 4 ℃ 保存；2) –20 ℃ 保存；3) 5 000 r/min 下离心 5 min 获得孢子湿 样，于 30 ℃ 烘干，孢子干样于 4 ℃ 保存；4) 同上制备孢子干样，于 –20 ℃ 保存；5) 将孢子悬浮 液置于 20% 甘油溶液中，于 4 ℃ 保存；6) 将孢子 悬浮液置于 20% 甘油溶液中，–20 ℃ 保存。60 d 后，从各保存样品中吸取少量样品，用无菌水分 别配制成浓度为每毫升含 1 × 106 个孢子的悬浮 液，参照 1.2.1 节的方法培育孢子，12 h 后调查孢 子的萌发情况，统计各保存方法下米根霉孢子的 萌发率，以其新成熟孢子的萌发率为对照，评价 保存条件对孢子萌发的影响。

数据采用 Microsoft Excel 2010 软件处理，以 药剂质量浓度对数值为横坐标、抑制率几率值为 纵坐标绘制毒力回归曲线，计算毒力回归方程及 有效抑制浓度 (EC50、EC90) 值。采用 DPS (7.05) 软件进行差异显著性分析。

在测试质量浓度范围内， 供试 6 种杀菌剂对烟草米根霉孢子萌发均表现出 了不同程度的抑制作用，其中，抑制活性最强的 是氟啶胺和啶酰菌胺，其 EC90 值分别为 0.67 和 1.53 mg/L；其次为代森锰锌和嘧菌酯，最弱的为 嘧霉胺和多菌灵。测定结果表明，代森锰锌、多菌灵、嘧霉 胺、嘧菌酯、啶酰菌胺和氟啶胺 6 种杀菌剂对烟 叶霉烂病的防治效果差异显著 (P < 0.05)。施药 24 h 后接种米根霉，代森锰锌、多菌灵和嘧霉胺各浓 度处理组烟叶均有发病，3 种药剂在最高质量浓度 (4 000、800 和 800 mg/L) 下的防效均低于 20% (具体数据略)；嘧菌酯、啶酰菌胺和氟啶胺各浓度处 理均能抑制烟叶霉烂病的发生，且随着药剂质量 浓度升高，防治效果均逐渐增强。其中嘧菌酯的 防效最好，50 mg/L 处理时可达 85%；其次为啶酰 菌胺，200 mg/L 处理的防效为 83%；氟啶胺的防 效相对较差，1 000 mg/L 处理时仅为 48%。保存前测得米根霉孢子 12 h 后的萌发率达 89%，经过 6 种方法保存 60 d 后，萌发率均显著 下降。其中，萌发率最高 (60%) 的为 4 ℃ 保存于 20% 甘油中的孢子悬浮液；其次分别为 4 ℃ 保存 的孢子干样、4 ℃ 保存的孢子悬浮液及 –20 ℃ 保 存于 20% 甘油中的孢子悬浮液；而 –20 ℃ 保存的 孢子干样和 –20 ℃ 保存的孢子悬浮液萌发率均较低。

作为重要的食品和工业微生物，米根霉的保 存方法已有诸多报道，然而，有关不同保存条 件对其孢子萌发的影响鲜有报道。本研究测定了米根霉在不同保存条件下存放 60 d 后孢子的萌发 活力，发现各种低温保存方法均不同程度地降低 了孢子的萌发率。后续还将考查更多种保存条件 及不同保存时间等对米根霉孢子活力的影响。烟叶烘烤过程中变黄期的温度和湿度尤其有 利于米根霉的侵染和产孢，同时由于烤房强力排 湿的需要，空气流动速度高，十分有利于病原菌 的扩散，因此在烟叶烘烤过程中米根霉可造成多 次侵染循环。但有关该病害的防治技术鲜有研 究报道，目前也没有登记相关防治药剂。笔者前 期调研发现，农药经销商推荐给烟农防治烟叶霉 烂病的药剂有多菌灵、嘧霉胺和代森锰锌等，这 些药剂是否具有防治效果尚不清楚。