恒温培养箱使用于火龙果软腐病病原菌的鉴定

火龙果 又名红龙果、情人果和 仙蜜果等，因外表肉质鳞片似龙鳞而得名，原产于墨 西哥南部及中美洲诸国的太平洋沿岸地区，现在我国 海南、福建、广东、广西、贵州和云南等省（自治区）均 有种植。大部分火龙果属于仙人掌科，量天尺属，其他则属于蛇鞭柱属。火龙果主要有三种 商业种类：红皮白肉火龙果、红皮 红肉火龙果和红皮深红肉火龙果。火龙果集水果、蔬菜、花卉于一体，营 养丰富，深受消费者青睐，具有广阔的发展前景。

感病的红皮深 红 肉 火 龙 果 于２０１７年４月 采 自 海南省昌江县某火龙果种植基地。

按常规方法对田间发病典型部位出现的症状进 行描述，并拍摄病害的症状。

采用常规组织分离法对病原菌进行分离，采 用琼脂平板稀释纯化法进行纯化，并将纯化菌株 转入试管斜面于４℃保存。

将保存的菌株于 ＰＤＡ 培养基上２５℃培养２ｄ。 采用刺伤接种法，在每个果实上刺伤４个点，在刺伤 点上接种菌丝块，以接种无菌 ＰＤＡ 培 养 基 为 对 照， 试验重复３次，用灭菌脱脂棉蘸取无菌水进行保湿， ２４ｈ后移去脱脂棉，在常温２５℃下，观察发病情况。 若接种果实发病则取发病部位再分离，完 成 柯 赫 氏 法则验证。

将病原菌接种于 ＰＤＡ 培养基上，２５℃全光照下 培养２～３ｄ，观察、记录菌株的菌落形状和颜色、病原 菌孢子的形状，测量孢子大小，并拍照。

ＤＮＡ 的提取及分子生物学鉴定 将供试病原菌接种于 ＰＤＡ 上，２５℃全光照下培 养２～３ｄ，用无菌药匙刮取菌丝体置于１．５ｍＬ无菌 离心管中，按照ＦｕｎｇａｌＤＮＡＫｉｔ真菌基因组 ＤＮＡ 快 速抽提试剂盒（ＯＭＥＧＡＢＩＯ－ＴＥＫ）说明，提取基因组ＤＮＡ。ＰＣＲ扩增试剂盒２×ＥｓＴａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、扩增 引物购自生工生物工程股份有限公司。 分别采 用 引 物ＩＴＳ１（５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣ－ ＣＴＧＣＧＧ－３′）／ＩＴＳ４（５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴ－ ＡＴＧＣ－３′）和 ＬＲＯＲ（５′－ＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＴＡＡ－ ＧＣ－３′）／ＬＲ７（５′－ＴＡＣＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＣＴ－３′）对 序列进行扩增。ＰＣＲ 反应体系（５０μＬ）：ＤＮＡ 模板 ２μＬ，上下游引物各２μＬ（１０μｍｏｌ／Ｌ），２×ＥｓＴａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１９μＬ。ＩＴＳ扩 增 程 序： ９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５５℃ 退 火４５ｓ， ７２℃延伸１ｍｉｎ，共３０个循环；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。 ＬＳＵ 扩增程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ， ５１℃退火４０ｓ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，共３０个循环；最 后７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存。 用１％琼脂 糖 凝 胶 电 泳 对 扩 增 产 物 进 行 检 测。 ＰＣＲ产物委托 华 大 基 因（深 圳）股 份 有 限 公 司 纯 化 和测序。测序 结 果 在 ＧｅｎＢａｎｋ 中 进 行 ＢＬＡＳＴ，并 下载相关序列，用 ＭＥＧＡ６．０软件采用邻接法构建 系统发育树。

将直径为５．０ｍｍ 的菌饼接于 ＰＤＡ 培 养 基 平 板中 央，分 别 置 于 １５、２０、２５、２８、３０、３２、３５、３７ 和 ４０℃共９个不同温度的培养箱中黑暗培养。每处理 重复３次。４８ｈ后用十字交叉法测量菌落直径。

ＰＤＡ 培养基灭菌以后，无 菌 条 件 下 用１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 和 １ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ溶 液 调 节 ＰＤＡ 培 养 基 的 ｐＨ，将直径为５．０ｍｍ 的菌饼分别置于ｐＨ 为３．０、 ４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０和１１．０的 ＰＤＡ 培养基平板上，于３２℃恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）中培养。每处理 重复３次。４８ｈ后用十字交叉法测量菌落直径。

将直径为５．０ｍｍ 的菌饼接于 ＰＤＡ 培 养 基 平 板中央，分别置于连续光照、Ｌ∥Ｄ＝１２ｈ∥１２ｈ、连 续黑暗的 ３２℃ 恒温培养箱中培养。每 处 理 重 复 ３ 次。４８ｈ后用十字交叉法测量菌落直径。

病害主要危 害 花 瓣、鳞 片 和 果 实。田 间 发 病 花 瓣首先凋萎，初期产生水渍状淡褐色病斑，病斑迅速扩展，造成整个花冠呈软腐状。

对健康的红皮 深 红 肉 火 龙 果 果 实 进 行 接 种，以 无菌的 ＰＤＡ 为对照，５ｄ后针刺伤接种的果实全部 发病，接种产生的症状与田间发病的症状相同（图 １ｇ～ｈ），而对照果实不发病（图１ｉ）。对发病组织进 行再分离，可得到与原分离株相同的病原菌，符合柯 赫氏法则，证明接种菌为火龙果软腐病的致病菌。

３ 结论与讨论

通过病害田间症状观察、致病性测定、病原菌形 态学及分子生物学鉴定，将引起海南红皮深红肉火 龙果软腐病病原确定为桃吉尔霉Ｇ．ｐｅｒｓｉｃａｒｉａ。火龙 果的腐烂病害大部分由镰孢属引起，对桃吉尔霉引 起的腐烂病害报道较少，有云南郭力维等报道的火 龙果果腐病，广西林珊宇等报道的火龙果软腐病， 而目前海南对桃吉尔霉属引起的软腐病并未见报道。 该病菌在国外报道还可侵染海南蒲桃、桃、茄 子、番木瓜和番茄等，甚至可侵染虾。 本研究由桃吉尔霉引起的红皮深红肉火龙果软 腐病与已经报道的匍枝根霉Ｒｈｉｚｏｐｕｓｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ 引 起的软腐病在症状上难以区别，但是病原菌形态 明显不同于匍枝根霉，匍枝根霉能产生假根和匍匐 菌丝，孢囊梗不分枝和不弯曲，而桃吉尔霉不能产生 假根和匍匐菌丝，孢囊梗多数１～２个 分 枝，个 别 孢 囊梗顶端弯曲。