脂肪酸合酶活性成分的提取分

动物脂肪酸合酶（Fatty acid synthase，FAS）是体 内催化合成长链脂肪酸途径中的关键酶，是能量代 谢的一个多功能复合酶。研究表明，近年来发现 FAS 成为新的减肥和抗癌的双重潜在靶点。开发具 有高活性、低毒性的 FAS 抑制剂，对癌症的防治具 有重大的意义 。迄今为止已报道的从天然产物中分 离得到的 FAS 抑制剂还很少，只有最早发现的天然 产物浅蓝菌素（cerulenin）和以浅蓝菌素结构为模版用化学方法合成的 C75，以及绿茶中的酯型儿茶素 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG） 和表儿茶素没 食子酸酯（ECG）。从天然中草药中寻找抑制活性更 高的 FAS 抑制剂是有重大意义的。

合欢皮，安徽盛海堂中药饮片有限公司；鸡肝 （江南大学无锡医学院动物房）；D101 大孔树脂（批 号：20170623），沧州宝恩吸附材料科技有限公司； 层析硅胶 200-300 目（批号：2017049），国药集团化学 试剂有限公司；GF254 硅胶板（批号：201700043）， 乳山市太阳干燥剂有限公司。 乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷均为分析 纯；甲醇（色谱纯，批号：13030126），美国 TEDIA 公司；超纯水（PALL CascadaLS），美国颇尔公司； 乙二胺四乙酸二钾盐（EDTA-2K，批号：327B032）， 北京索莱宝科技有限公司；二硫苏糖醇（DTT，批 号：C10114900），上海麦克林生化科技有限公司； 乙酰辅酶 A（批号：435K022），北京索莱宝科技有限 公司；还原型辅酶Ⅱ（NADPH）（批号：1128J022）， 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 ； 油 酸（OA， 批 号 ： 5827240），北京索莱宝科技有限公司；无游离脂肪 酸的牛血清白蛋白（BSA，批号：2626940），北京索莱 宝科技有限公司；油红 O 染色液（批号：1219D051）， 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 ； EGCG（ 批 号 ： 7264D102），北京索来宝科技有限公司；丙二酰辅酶 A（批号：TFGL6264K），美国 Sigma 化学试剂有限公 司；棕榈酸（PA，批号：MKBQ7543V），美国 Sigma 化 学 试 剂 有 限 公 司 ； 磷 酸 氢 二 钾（ 批 号 ： 20130923），国药集团化学试剂有限公司；磷酸二氢 钾（批号：20160516），国药集团化学试剂有限公 司；碳酸氢钾（批号：20151005），国药集团化学试 剂有限公司；DMEM 培养基（批号：AD23420270）， 美国 Hyclone 公司；胎牛血清（批号：OX0524），上 海双洳公司；胰蛋白酶（批号：2231041），北京索莱 宝科技有限公司。 细胞培养皿（批号：430167），美国 CORNING 公 司；12 孔板（批号：8054899），美国 Thermo 公司。

旋转蒸发仪（RE-52A），上海亚荣生化仪 器厂；超高速多功能粉碎机（SZ-1000A-3），永康市 善竹贸易有限公司；真空干燥箱（DZF-1），上海博泰 实验设备有限公司；三用紫外分析仪（ZF-1），海门 市其林贝尔仪器制造有限公司；高功率数控超声波 清洗器（KQ-800KDE），昆山市超声仪有限公司；分 析天平（AL104），瑞士梅特勒-托利多（上海）仪器有 限公司；数显恒温水浴锅（HH-2），上海精宏实验设 备有限公司；循环水真空泵（SHZ-DⅢ），巩义市予 华仪器有限责任公司；半制备高效液相色谱仪（1525 系列），美国 Waters 公司；全功能微孔板检测仪 （Synergy H4），美国 BioTek 有限公司；小型台式离 心机（MedifugeTM），南京宝诚生物技术有限公司； 超速冷冻离心机（80 000 rpm/CP80NX 型），上海旦鼎 国际贸易有限公司。

FAS 上清液参考该方法所得，在此基础 上，通过酶标仪测定 NADPH 的变化值来测定活性。 于含有 1 mmol·L- 1 EDTA、pH 值为 7、浓度为 0.1 mmol·L-1 的磷酸钾缓冲液中进行，底物浓度为乙酰 CoA 6 μmol·L-1 ，丙二酰 CoA 12 μmol·L-1 ，NADPH 37.5 μmol·L-1 ，体积为 2 mL，于 37 ℃水浴恒温 4～ 5 min，加入 50 μL 稀释后的高速离心上清液启动酶 反应，采用酶标仪测定。每次从反映体系中吸取 200 μL 反应体系溶液于 340 nm 波长处连续监测吸光 度变化。 动物 FAS 的活性单位（U）规定为每分钟氧化 14 nmol NADPH 的酶量，每毫升高速离心上清液酶活力 用下式计算：Activity(V/L) = △A340 nm ε × V × 106 14 × C。式 中：V 为测定酶活的体积数 0.000 2 L；C 为稀释倍 数；106 为 mmol 转换为 nmol 系数；△A340 nm 为 340 nm 波长下的吸光度变化值；ε 为 NADPH 氧化为 NADP+ 时在 340 nm 波长处的毫摩尔消光系数，此处 为 6.022 L·mmol-1 。 被测样品加入反应体系，加入 FAS 启动反应， 测得酶活为 A，空白对照酶活为 A0，A/A0 为剩余活 性（R.A），R.A 越小，酶反应抑制程度越高，表明样 品的抑制酶活性能力越强。

将合欢皮药材 2.5 kg 打 碎成粉，加入 75%乙醇，在 75 ℃下用水浴回流提取 两次，料液比为 1∶10 g·mL-1 ，回流提取时间为 2 h。合并两次提取液，减压浓缩，真空干燥，得到合欢皮 总提取物 AJ-T 250 g。总提取物用蒸馏水溶解，然后 分别用乙酸乙酯、水饱和正丁醇分级萃取，萃取液 减压浓缩，分别得到乙酸乙酯相（124.7 g）、正丁醇 相 AJ-B（52.4 g）、母液水相（23.5 g）。

取 AJ-B 干粉 20 g， 用去离子水溶解，水溶液经过 D101 大孔树脂柱洗 脱，依次用 3 倍柱体积的水、30%乙醇、50%乙醇、 70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，得到 4 个组分：30% 乙醇洗脱组分（AJ-B-1），50%乙醇洗脱组分（AJ-B2），70%乙醇洗脱组分（AJ-B-3），95%乙醇洗脱组分 （AJ-B-4）。4 个组分通过上述方法进行酶活测定， 筛选出活性最高的组分。

通过薄层色谱 法，确定洗脱剂为二氯甲烷-甲醇。选取粒径为 200~ 300 目硅胶分离，硅胶干法上样，薄层色谱法实时检 测并收集合并组分。用旋转蒸发仪浓缩，共得到 6 个组分：Fr1、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6。6 个组分 通过酶活测定，筛选出活性最高的组分 Fr4。

Fr4 组分 采用半制备型 高效液相色谱（HPLC）对 Fr4 进行分离，使用 Waters 1525 半制备高效液相色谱仪，C18 色谱柱；流动相： 0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）；检测波长：254 nm； 流动相梯度洗脱程序：0～15 min：10%～30% B； 15～50 min：30%～38%B；50～65 min：38%～80%B； 65～66 min：80%～100% B；66～76 min：100% B； 76～80 min：100%～20%B；80～85 min：20%B。 共收集到 4 个化合物 H1、H2、H3、H4，对应 的出峰时间为 32.35、34.4、38.9、45.72 min。酶活 测定筛选出活性最高的化合物 H2，通过 LC-MS，核 磁共振波普确定化合物 H2 为无梗五加苷 B。

根据 HepG2 细胞 的生长状态，选择高糖的含有 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，置于 37 ℃、5%CO2湿润环境的培养 箱中培养细胞，细胞长至 80%～90%时传代接种，选 取对数生长期的细胞进行试验。将 HepG2 细胞吹散 均匀接种到 12 孔板，细胞密度为 4×105 个·mL-1 ，每 孔终体积 1 mL。造模前用无血清培养基饥饿细胞 12 h， 在 HepG2 细胞常规培养的同时以 2∶1 加入 OA 和 PA，总浓度为 1 nmol·L-1 。为去除血清中脂肪酸的干 扰，同时满足细胞的生长，采用无游离脂肪酸的 5% BSA 培养细胞。置于 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养，造模 24 h 之后，分空白组、造模组、给药组、阳性 对照组（EGCG）。给药处理 24 h 之后进行油红 O 染 色。给药处理 24 h 之后，小心轻缓倒去培养液，磷 酸缓冲盐溶液（PBS）漂洗 2 次，10%中性甲醛固定 30 min；PBS 漂洗，油红工作液染色 20 min，60%异 丙醇脱色处理。倒置显微镜下观察细胞内脂滴染色 情况。

所有数据均以“均值±标准差” （x ± s）表示，利用统计软件 SPSS17.0 对数据进行分 析，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组 间两两比较采用独立样本 t 检验。P＜0.05 为差异有 统计学意义。

大孔树脂不同洗脱组分对 FAS 活性的抑制 通 过大孔树脂洗脱，并且对不同的洗脱组分进行抑酶 活性比较，每组实验重复 3 次。结果如图 1 所示。 在同一浓度的不同洗脱部位组分对脂肪酸合酶的抑 制作用结果显示：相比较于其他组分，30%洗脱组分 （AJ-B-1）对脂肪酸合酶的抑制作用最强。

关于天然产物中抑制脂肪酸合酶活性成分的报道 有很多，但是大多是研究到其活性组分，从天然产 物中分离纯化得到的抑制脂肪酸合酶活性的化合物 还非常少。本实验室长期从事合欢皮 AJ-B 活性的药 理研究，前期实验室的李曰研究表明：在动物实验 上，合欢皮 AJ-B 对脂肪酸合酶的蛋白表达水平上有 抑制作用。因此，为了比较全面地研究合欢皮中抑 制 FAS 的活性组分，我们选用合欢皮 AJ-B 作为起始 点。本研究以抑制 FAS 活性为导向筛选合欢皮正丁 醇相中的活性化合物，通过大孔吸附树脂在不同的 乙醇浓度下洗脱，富集到抑制 FAS 活性较高的 30% 乙醇洗脱段，30%乙醇洗脱段在硅胶柱层析分离下得 到抗 FAS 活性较高的的组分 Fr4。使用半制备液相色 谱分离 Fr4，进一步得到抗 FAS 活性较强的化合物 H2。结合质谱和核磁共振技术鉴定该化合物为无梗 五加苷 B。在细胞实验上发现无梗五加苷 B 对肿瘤 细胞脂滴的生成具有抑制作用，我们推测其可能是 通过抑制 FAS 的活性从而抑制脂滴的生成，但其具体确切的作用机制还有待研究。因此，我们将继续 深入研究其降脂的作用机制，期待在更深层次的药 理机制上有所贡献。