地西他滨诱导表达克制肾癌细胞侵袭迁移

肾细胞癌简称肾癌，是泌尿系统最常见的恶 性肿瘤之一，全球每年有超过 30 万例新增患者。 肾癌分别占男性和女性所有恶性肿瘤的5%和3%， 发病率在男性癌症患者中排第 7 位，女性癌症患 者中排第 10 位。目前，肾癌治疗的最有效方式是手术切除。肾癌分多种病理亚型，透明性肾细 胞癌是最常见的一种亚型，约占肾癌的 70%~85%， 其他还有乳头状肾细胞癌，约占肾癌 7%~15%；嫌 色细胞癌占 5%~10%，还有少数具有罕见组织形态 学的肾细胞癌<1%。早期肾癌往往不易被察觉，有20%~30%的肾癌患者在检出时已发生转移，转移 性肾癌患者预后差，5 年生存率低。一旦肾癌发 生远处转移，则失去了手术切除进行根治的机会， 因此，在肿瘤患者出现远处转移之前对患者进行 抑制肿瘤转移性治疗至关重要。

人肾细胞癌786-O和769-P细胞系购于中国科 学院典型培养物保藏委员会细胞库;7 对配对肾癌 及癌旁组织来自浙江省肿瘤医院(伦理批件: IRB-2017-2);RPMI 1640 培养基(GIBCOTM,批号: 31800-022);丙酮酸钠溶液(Sigma,批号:S8636); 青链霉素溶液 100×(杭州科易,批号:CP011);胰 酶粉末(GIBCOTM,批号:27250-018);地西他滨 (Sigma,批号:A3656);二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide , DMSO , Sigma ,批号: D5879) ; Lipofectamine 3000 Transfection Kit(Thermo Fisher,批号:1946890);总 RNA 提取试剂盒 (Axygen,批号:APMN-MS-RNA-250);RNAsimple 总 RNA 提取试剂盒(天根,批号:DP419); PrimeScriptTM RT Master Mix 逆转录试剂盒(Takara ,批号: DRR036A) ; PrimeScriptTM RT reagent Kit 逆转录试剂盒 (Takara ,批号: RR037A);SYBRTM Premix Ex TaqTM 实时荧光定量 PCR 试剂盒(Takara,DRR420A);BCA 蛋白浓度 测定试剂盒(碧云天,批号:P0010);RIPA 强裂解 液(碧云天,批号:P0013B);一抗稀释液(碧云天, 批号:P0023A);钙黏蛋白抗体(Abcam,批号: ab133597);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(联 科,批号:Mab5465);miR-200c 和 miR-141 类似 物由上海吉玛公司合成。

二氧化碳培养箱(Thermo);生物安全柜(Heal Force);HVE-50 灭菌锅(HIRAYAMA);显微镜 (Nikon);电热恒温水槽(上海精宏);高速离心机 (Eppendorff);StepOnePlu 实时荧光定量 PCR 系统 (Applied Biosystems);电泳仪(Bio-Rad);制冰机 (SCOTSMAN);超低温冰箱(Thermo Forma)。

786-O 和 769-P 细胞分别用 0.05%胰酶消化 2 min,培养于含 10%胎牛血清､1×青链霉素和 1× 丙酮酸钠溶液的 1640 培养基,置于 37 ℃,5% CO2 细胞培养箱中培养,每 2~3 d 传代 1 次｡细胞给药: 地西他滨溶于 DMSO 配制成 25 mmol·L-1 的母液, 786-O 和 769-P 细胞种于 6 孔板,对照组每孔加入 2 mL DMSO,给药组每孔加入 2 mL 2.5 mmol·L-1 地 西他滨,使终浓度为 2.5 mmol·L-1 ,连续给药诱导 3 d｡细胞转染:基于 1640 培养基体积计算浓度, 细胞转染 miR-NC､miR-200c 以及 miR-141 的终浓 度为 30 nmol·L-1 ,转染试剂 Lipofectamine 3000 的 浓度为 2‰。

用 RNAsimple 总 RNA 提取试剂盒提取组织 RNA,用 Axygen 总 RNA 提取试剂盒提取细胞 RNA｡Takara RR036A 逆转录试剂盒用于 mRNA 的逆转录,Takara RR037A 逆转录试剂盒用于 miRNA 的逆转录｡miRNA 逆转录特异性引物序列: miR-200a:5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGG AGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACATCG3’;miR-200b:5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTCG TGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAT CA-3’;miR-200c:5’-GTCGTATCCAGTGCGTGTC GTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCC

786-O 和 769-P 细胞接种于 6 孔板中,基于 1640 培养基体积计算浓度,加入终浓度为 2.5 μmol·L-1 地西他滨诱导 3 d 或转染 30 nmol·L-1 的 miR-200c/141 2 d 后,用 200 μL 枪头划线,PBS 清洗黏附的细胞碎片,培养基换为无血清培养基｡ 分别于划线 0,24 h 后用配置有尼康数码照相机的 尼康倒置镜像显微镜进行拍照。

前一晚用空白 1640 培养基稀释基质胶,将稀 释好的基质胶溶液加到 Transwell 小室中,第 2 天 吸去 Transwell 小室中液体,可见底部有一层白色 薄膜,即凝固的基质胶,Transwell 小室下加入 600 μL 1640 完全培养基｡ 786-O 和 769-P 细胞接种于 6 孔板中,基于 1640 培养基体积计算浓度,加入终浓度为 2.5 μmol·L-1 地西他滨诱导 3 d 或转染 miR-200c/141 2 d 后,0.05%胰蛋白酶消化计数, 10 000 个细胞每孔种于铺好胶的 Transwell 小室 中｡置于37 ℃,5% CO2的细胞培养箱中培养 24 h, 吸走培养基,PBS 洗 2 次,4%多聚甲醛固定 1 h, 棉签拭去小室上层细胞,结晶紫染色 1 h,PBS 洗 2 次,用配有尼康数码照相机的尼康倒置镜像显微 镜进行拍照。

786-O 和 769-P 细胞接种于 6 孔板中,基于 1640 培养基体积计算浓度,加入终浓度为 2.5 μmol·L-1 地西他滨诱导 3 d 后,吸走培养基, PBS 洗 2 次,100 μL RIPA 裂解液提取细胞蛋白, 4 ℃旋转 30 min 充分裂解细胞,12 000 r·min-1 ,4 ℃离心 10 min,BCA 试剂盒测定蛋白浓度,蛋 白质印迹法进行检测｡分离胶浓度 10%,浓缩胶 浓度 5%,上样量 10 μL,电压 90 V 电泳约 30 min, 电压 120 V 电泳约 90 min｡电泳结束后取出蛋白 胶,按胶面大小裁剪合适大小的聚偏二氟乙烯膜, 在背面做好标记后浸泡在甲醇中活化,电转夹层 从负极(黑色)至正极(红色)依次铺置海绵､滤纸､ 蛋白胶､PVDF 膜､滤纸､海绵,将电转夹层按正 确方向组装于电转槽,加入电转缓冲液至标示指 示线,在冰浴条件下以 200 mA 电转 2 h｡电转结 束后聚偏二氟乙烯膜用 5%奶粉室温封闭 2 h,一 抗 4 ℃孵育过夜,二抗室温孵育 2 h,G-BOX 化 学发光成像仪显色曝光。

用 Image J 进行细胞计数及划痕面积计算｡用 GraphPad Prism 6.0 进行统计分析。

在肾癌组织中显著下调 实时荧光定量 PCR 检测 7 对配对肾癌及癌旁 组织中 miR-200c/141 表达水平,结果肾癌组织与 其配对癌旁组织相比,miR-200c/141 表达水平均 显著下调,见图 1｡患者组织信息见表 1

2.2 miR-200c/141

抑制肾癌细胞侵袭迁移 在 786-O 和 769-P 细胞中转染 miR-200c/141， 2 d 后用 200 μL 枪头划线，吸走完全培养基，替换 成无血清培养基，分别在 0，24 h 拍照。转染了 miR-200c/141 后，细胞迁移能力显著减弱，见图 2。 在 786-O 和 769-P 细胞中转染 miR-200c/141 后， 进行 Transwell 实验。结果表明，细胞侵袭能力显 著下降，见图 3。因此，miR-200c/141 可以抑制肾 癌细胞系 786-O 和 769-P 的侵袭迁移能力。

3 讨论

DNA甲基化是研究最广泛的表观遗传机制， 在胚胎发育、细胞增殖以及肿瘤的发生发展中都 起着重要作用，主要由 DNA甲基转移酶催化完成。 基因启动子区域甲基化水平调控基因的表达，在癌症中，一些抑癌基因的启动子区域高甲基化抑 制抑癌基因的表达，原癌基因启动子区域低甲基化 促进原癌基因的表达，最终促进癌症进程。有 研究者认为，DNA 甲基化是药物治疗癌症的理想 靶点，目前有大量 DNA 甲基转移酶抑制剂正在研 发。地西他滨作为 DNA 甲基转移酶抑制剂已被美 国 FDA 批准用于临床，通过抑制 DNA 甲基转移酶 活性影响基因甲基化水平进而调控基因的表达。