溃疡性结肠炎小鼠的作用-恒温培养箱使用

炎症性肠病( inflammatory bowel disease，IBD) 是一 种累及回肠、直肠、结肠的特发性、慢性和复发性肠道 炎症性疾病，包括克罗恩病( Crohn’s disease，CD) 和 溃疡性结肠炎( ulcerative colitis，UC) ，多见于青壮年。 临床表现为腹泻、腹痛、血便、体质量减轻等。IBD 过 去多见于西方发达国家，近年来，亚洲地区发病率呈上 升趋势，流行病学研究显示我国炎症性肠病的发病率 高达 3．44%，居亚洲之首。

1 材料与方法

1．1 实验动物

雄性 C57BL /6J 小鼠 24 只，6 ～ 8 周 龄，体质量( 22±2) g，购自湖北省实验动物研究中心， 实验动物生产许可证号: SCXK( 鄂) 2015-0018。饲养 于华中科技大学医学院附属同济医院动物房，动物饲 养环境温度为 ( 22±2) ℃，相对湿度为 ( 50±5) %。

1．2 药物及试剂

茜草藤，2014 年 9 月采于陕西省汉 中地区，经华中科技大学同济医学院药学院张勇慧教授鉴定为茜草的地上部分，标本存放于华中科技大学 同济医学院药学院，编号为: NP2014100703。葡聚糖 硫酸钠( DSS) 相对分子质量为 35 000 ～ 50 000( 美国 MP 公司，批号: 160110) 。小鼠白细胞介素( IL) -1β、 肿瘤坏死因子-α( TNF-α) 、干扰素-γ( IFN-γ) 酶联免 疫吸附测定( ELISA) 试剂盒( Elk biotechnology 公司， 批号分别为 ELK1271，ELK1395，ELK1132) 。

1．3 仪器

酶标仪( Diatek 公司，型号: DＲ-200Bs) ，恒 温培 养 箱 ( 上海精宏实验设备有限公司，型 号: GNP9160) ，制冰机( 常熟市雪科电器有限公司，型号: IMS-20) 。

1．4 实验分组

将 24 只 C57BL /6J 小鼠采用体质量 分层随机数字表法分为空白对照组，模型对照组，茜草 藤大、小剂量组，每组 6 只。

1．5 茜草藤水提物的制备

称取粉碎后的茜草藤 1000 g，加水至没过药材，浸泡 30 min，煎煮 1 h，将水 煎液转移，再加水至没过药材，煎煮 1 h，合并水煎液， 静置 2 h，依次用脱脂棉、滤纸滤过。将滤过液置旋转 蒸发仪中减压浓缩( 温度 65 ℃ ) ，将浓缩至约1000 mL 的水煎液放置－20 ℃冰箱保存，待用。

1．6 造模方法及药物干预

茜草藤大、小剂量组分别 预防性灌胃茜草藤提取物 4．8，1．2 g·kg－1 ，预防性给 予 3 d，空白对照组和模型对照组灌胃等体积纯化水; 模型对照组和茜草藤大、小剂量组分别给予 3% DSS 溶液造模，自由饮用，连续饮用 7 d，空白对照组小鼠 给予纯化水饮用，直到实验第 10 天。小鼠灌胃药物， 给药体积为 20 mL·kg－1 ，每天 1 次，空白对照组小鼠 给予纯化水。

1．7 疾病活动度评分

造模前、造模后和给药后分别 观察小鼠精神及活动状况，每天记录小鼠体质量变 化、大便性状及便血情况，计算疾病活动指数( disease activity index，DAI) 。体质量变化 ( %) = ( 造模后体 质量－造模前体质量) /造模前体质量×100%。评分如 下，①0 分: 体质量无变化，大便正常，无便血; ②1 分: 体质量变化 1% ～5%，便软，成型，有便血点; ③2 分: 体 质量变化 5% ～10%，大便有黏液，成型，成块便血; ④3 分: 体质量变化 10% ～ 15%，便软，有黏液，成型，成片 的便血; ⑤4 分: 体质量变化 15% ～20%，便软，有黏液， 不成型，便血及肛门肿胀。

1． 8 样 本 采 集 实 验

结 束 后，眼 球 取 血，以3500 r·min－1 离心 10 min，取上层血清、分装，然后放 置－80 ℃冰箱备用; 剖腹后，摘取小鼠脾脏，测量脾脏 长度及称定脾脏质量，脾脏指数 = 脾脏总质量( mg) / 小鼠质量( g) ; 剪取距肛门以上 2 cm 结肠，取病变最 明显处结肠组织于 4%多聚甲醛中，留作病理切片及 免疫组化，再取结肠组织若干移至－80℃冰箱备用。

1．9 苏木精-伊红( HE) 染色检测

按常规包埋、切 片，厚度为 4 μm，进行 HE 染色，高倍显微镜下选取视 野，根据溃疡大小、炎症浸润和结构损伤程度等进行结 肠组织病变损伤程度统计和比较，组织学评分标准如 下，①炎症反应严重程度，0 分: 无，1 分: 轻微的，2 分: 中等的，3 分，严重的; ②炎性反应范围，0 分: 无，1 分: 黏膜，2 分: 黏膜和黏膜下层，3 分，透壁的; ③隐窝破坏 程度，0 分: 无，1 分: 1 /3 破坏，2 分: 2 /3 破坏，3 分，隐 窝消失伴上皮细胞出现，4 分: 隐窝及上皮细胞均消失。

2 结果

茜草藤对 DSS 诱导的 UC 小鼠的 体质量影响见图 1。空白对照组小鼠在实验期间体质 量均上升，一般状态良好。小鼠饮用含 3%DSS 饮用水 后，3 组小鼠体质量均不同程度下降。实验第 7 天，与 正常对照组比较，模型对照组体质量明显减少( P ＜ 0．01) ，模型对照组在实验第 7 ～ 10 天体质量均下降， 且第 9 和第 10 天下降最明显。茜草藤大、小剂量组体 质量均较模型对照组偏高，第 8 天，与模型对照组比较 差异有统计学意义( 均 P＜0．05) 。

茜草藤对 DSS 诱导的 UC 小鼠 DAI 评 分见图 2。空白对照组小鼠体质量有所增加，大便硬度 适中，黑褐色，椭圆形，无稀便及血便，故其 DAI 评分主 要是其体质量波动评分。模型对照组小鼠饮用 3%DSS4 d 后，大便性状开始变化，先是成形大便，然后逐渐变 为稀松大便，甚至是水样泻，第 5 天部分小鼠出现血便， DAI 评分显著升高; 茜草藤大、小剂量组小鼠在造模后 也出现体质量降低、大便性状改变，以及腹泻、血便等症 状，但症状明显比模型对照组轻。与空白对照组比较， 模型对照组小鼠在第 5 天 DAI 评分均显著升高，差异有 统计学意义( P＜0．01) ，茜草藤大、小剂量组 DAI 评分也 升高，但造模后 DAI 评分均低于模型对照组，第 6 天 DAI 评分显著低于模型对照组( P＜0．05) 。

3 讨论

UC 是目前重点研究的一种慢性疾病，UC 模型的 建立是研究生理病理工作的第一步，目前常用于 UC 基础药物研究的造模方法为化学诱导法，其中 DSS 诱 导的模型是最广泛使用的模型。因此本课题组选 择 DSS 诱导 UC 模型进行实验研究，以评价茜草藤水 提物对 UC 的预防作用。