匙叶翼首草发根诱导分析！！！

匙叶翼首草 （Ｐｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓｈｏｏｋｅｒｉ （Ｃ．Ｂ． Ｃｌａｒｋｅ）Ｈｏｃｋ．）属川续断科（Ｄｉｐｓａｃａｃｅａｅ）翼首花 属（Ｐｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）的一种藏药材，藏语音译为榜 孜毒乌、榜子毒乌、榜孜夺吾等，在“南派藏医药” 中被喻为地 上“七 种 仙 草”之一。《中 国药 典》 ２０１５年版收 录，记 载 其 味 苦，性 寒，有小毒，具 有 解毒除瘟，清热止痢，祛风通痹的功效；还收录如 十 二 味 翼 首 散、洁白丸等含翼首草的藏药复方制剂。

１ 材料与方法

１．１ 试验材料

供试种子采自西藏巴宜区百巴镇扎 地 村，由 西藏农牧学院食品科学学院兰小中教授鉴定为川 续断科翼首草属匙叶翼首草 （Ｐｔｅｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｈｏｏｋｅｒｉ （Ｃ．Ｂ．Ｃｌａｒｋｅ）Ｈｏｃｋ．）。 供 试 菌 株 为 Ｃ５８Ｃ１（ｐＲｉＡ４），由 重庆 市 甘 薯 工 程 技 术 中 心 保 存与惠赠。 供 试 仪 器：高 效 液 相 色 谱 仪 （岛 津，ＬＡ２０ 型）；ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｃ１０００型），DHG-9070A鼓风干燥箱（上海精宏试验设备有限公司）；电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司，ＪＡ２００３型），全自动高压蒸汽灭菌锅（ＭＬＳ－３７８０型，日本日立）；齐墩果酸 与熊 果 酸 标 准 品 （９８％，美 仑 生 物 公 司），甲 醇 （ＨＰＬＣ 级，Ｈｏｍｅｙｗｅｌｌ 公 司 ）。 ＭＳ、１／４ ＭＳ、 Ｂ５、１／２Ｂ５、ＷＰＭ 等 培养 基（青 岛 海 博 公 司）；超 纯水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，明 澈－Ｄ２４ ＵＶ）；其 余试 剂 为 分 析纯。 供 试 引 物：ｒｏｌＢ Ｆ ５′－ＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴ－ ＧＣＴＡＧＡＴＴＴ－３′， ｒｏｌＢ Ｒ： ５′－ＧＡＡＧＧＴＧ－ ＣＡＡＧＣＴＡＣＣＴＣＴＣ－３′；ｒｏｌＣＦ：５′－ＴＡＡＣＡＴＧ－ ＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＣ－３′，ｒｏｌＣ Ｒ：５′－ＡＡＡＣＴＴ－ ＧＣＡＣＴＣＧＣＣＡＴＧＣＣ－３′（上海英骏公司合成）。

１．２ 试验方法

１．２．１ 农杆菌活化与培养

２８ ℃在 ＹＥＰ 平板（利福 平４０ｍｇ·Ｌ－１）划线培养，２ｄ。挑 取 单 菌 落 于１ｍＬ ＹＥＰ（利 福平 ４０ｍｇ·Ｌ－１）培养基，２００ｒ·ｍｉｎ－１，２８ ℃过夜培 养，取１ｍＬ菌液扩大培养５０ｍＬ，ＯＤ６００吸光度为 ０．５～０．６时，室温下４０００ｒ·ｍｉｎ－１，离心１０ｍｉｎ， 然后 ＭＳ重悬液（含乙酰丁香酮 ２０ｍｇ·Ｌ－１）重 悬，在上述条件下培养３０ｍｉｎ后可用于转化。

１．２．２ 发根的诱导

采用叶盘法，将翼首草无菌苗的叶片 在 超 净 台剪成０．５～１．０ｃｍ 的叶段。在 ＭＳ重悬液中浸 染８、１５ｍｉｎ。转接至 ＭＳ固体培养基（含乙酰丁 香酮２０ｍｇ·Ｌ－１），分别暗培养 １、２ｄ后转移至 ＭＳ固体培养 基（含 头 孢 噻 肟 钠２００ｍｇ·Ｌ－１）， ２５ ℃，黑暗培养，每周更换１次培养基 直 到 获 得 无菌的发根。

１．２．３ 发根检测

取新 鲜 发 根 ０．５ ｇ，用 ＣＴＡＢ 法 提 取 总 ＤＮＡ，作为 ＰＣＲ 检测模 板。２５μＬ 体 系：ｄｄＨ２Ｏ ２０μＬ，１０× ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（含 ＭｇＣｌ２ ）２．５ μＬ， １０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，ｄＮＴＰｓ０．５μＬ，上 下 游 引 物 各 ０．５μＬ，模 板 ＤＮＡ ０．５μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （５Ｕ·μＬ－１）０．５μＬ。９５℃ 预变性５ｍｉｎ；９４℃ 变性３０ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个 循环；７２ ℃，８ ｍｉｎ。１％的琼脂糖凝胶进行电泳 鉴定。

１．２．４ 不同液体培养基培养

将除菌完成的翼首草发根分别接种０．２ｇ于 ８０ｍＬ的１／２Ｂ５、Ｂ５、ＷＰＭ、ＭＳ、１／４ ＭＳ液体培 养基（蔗糖均为３０ｇ·Ｌ－１，ｐＨ 调至５．８，３个 重 复），在恒温摇床中１１０ｒ·ｍｉｎ－１，２５ ℃，黑 暗培 养２个月。在４０℃烘箱烘干，研钵磨细。取发根 的根尖１ｃｍ 于各固体培养基上，２５ ℃，黑暗培养 １个月。

１．２．５ 齐墩果酸与熊果酸的提取

齐墩果酸与熊果酸的提取方法参考《中国药 典》２０１５年 版，准确 称 取０．２００ｇ翼 首草 发 根 干 粉，加入３０ｍＬ 甲醇，在超声清洗仪以８０％功率 清洗３０ｍｉｎ，滤纸过 滤 后 于４０ ℃烘 干，５ｍＬ 甲 醇溶解，过０．２２μｍ 滤膜，４ ℃保存备用。 １．２．６ 色谱条件 岛津 ＯＤＳＣ１８色谱柱（４．６ｍｍ×２５０．０ｍｍ， ５μｍ）；流动相：甲醇－０．１ｍｏｌ·Ｌ－１：乙酸铵溶液 （８５∶１５），流速１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长２１０ｎｍ；柱温箱３５ ℃；近样体积１０μＬ。

２ 结果与分析

由于翼首草的叶片为草质且带有很多腺毛， 共培后易感染菌，所以确定一个合适的共培与浸 染时间对于优化翼首草发根诱导较为重要。共培 养１ｄ浸染８ｍｉｎ效果较好，诱导率为１２％。随 着浸染时间与共培时间增加，翼首草叶片的受损 与长菌的几率增加如表１所示。

以 Ｃ５８Ｃ１（ＰＲｉＡ４）为阳性对照，能扩增出ｒｏｌ Ｃ（６２６ｂｐ）与ｒｏｌＢ（４３２ｂｐ）基因，阴性对照以水为模板，没 有 扩 增 出 条 带。以２个 根 系 ＤＮＡ 为 模板进 行 ＰＣＲ，可 以 检 测 到ｒｏｌＣ、ｒｏｌＢ 基 因ＭＳ培养基为营养富集型培养基，其 无 机 盐 浓度较高，各元素比例均衡，营养丰富，微量元素 较为全面，是目前应用较广的培养基。１／４ＭＳ培 养基为 ＭＳ培养基大量元素浓度的１／４，无 机 盐 浓度较低，为低无机盐培养基。Ｂ５培养基为硝酸钾高 培 养 基，铵 态 氮 含 量 低。 翼 首 草 发 根 在 １／４ＭＳ中生长速度最快生物量最大，其 中 鲜 质 量 达９．２１０ｇ、干质量达０．５２９ｇ，但毛状根有类似愈 伤组织、较松散成团状，颜色较白，含水量较高，其 次 为 Ｂ５ 培养基鲜质量达 ５．２７０ｇ、干 质 量 达 ０．３８５ｇ，１／２Ｂ５的生物量最小干质量仅０．２４２ｇ。 在５种固体培养基上以 Ｂ５与１／４ＭＳ生长最快， ＷＰＭ 培养基生长较慢长势较差，从 生 物 量 上 可 以看出，翼首草发根在固体与液体培养基生长情 况基本一致。

３ 讨论

翼首草的毛状根因为叶片表皮具有腺毛等附 属结构易残留农杆菌，需控制浸染时间与共培时 间，该试验以共培养１ｄ，浸染８ｍｉｎ的效果最好。 不同的培养基由于化学成分和各组分比例不同，对翼首草发根的生长、次生代谢产物合成具有影 响。ＭＳ为植物基本培养基具有无机盐浓度较 高，硝 酸 盐 含 量 高，铵 盐 含 量 较 高 （ＫＮＯ３ １９００ｍｇ·Ｌ－１、ＮＨ４ＮＯ３６５０ｍｇ·Ｌ－１）的特点； １／４ＭＳ培养基为 ＭＳ培养基大量元素减少到１／４，具 有无机盐浓度较低的特点；Ｂ５培养基的主要特点是 含有较低的铵盐（其中 ＮＨ４ＳＯ４１１３ｍｇ·Ｌ－１），较高 的硝酸盐（ＫＮＯ３ ２５００ ｍｇ·Ｌ－１）；１／２Ｂ５为 Ｂ５培养基大量 元 素 减 半；ＷＰＭ 培养基为木本植物 培养基（其 中 Ｃａ（ＮＯ３）２ ·４Ｈ２Ｏ５５６ｍｇ·Ｌ－１， ＮＨ４ＮＯ３４００ｍｇ·Ｌ－１）。