氨基糖苷类修饰酶基因的研究与分析

随着大量广谱抗菌药物的广泛和不合理应用，铜 绿假单胞菌对氨基糖苷类药物的耐药性日趋 严 重。 而氨基糖苷类修饰酶介导耐药的多重耐药铜绿假单 胞菌可引起呼吸道感染、泌尿道感染、菌血症、心内膜 炎 和 囊 性 纤 维 变 性 等 疾 病，往 往 会 给 重 症 监 护 室 （ＩＣＵ）合并感染的患者带来更为严重的后果和经济损 失。本研究通过 ＰＣＲ 检测４种氨基糖苷类修饰酶基 因ａｎｔ（２″）－Ⅰ、ａｎｔ（３″）－Ⅰ、ａｎｃ（６′）－Ⅰ和ａｎｃ（６′）－Ⅱ， 探讨其在ＩＣＵ 多重耐药铜绿假单胞菌中的表达情况， 分析多重耐药铜绿假单胞菌中氨基糖苷类修饰酶介 导的耐药机制，从而为ＩＣＵ 临床医师的合理用药提供 理论依据。

１ 材料与方法

１．１ 菌株来源

选择２０１７年１月至２０１８年１２月本 院ＩＣＵ 临床标本中分离的６０株多重耐药铜绿假单胞 菌株为研究对象，所有试验菌株均经法国生物梅里埃 公司 ＶＩＴＥＫ－２型全自动细菌鉴定／药敏分析系统鉴 定。质控菌株为 ＡＴＣＣ２７８５３。

１．２ 试剂与仪器

ＴａｑＤＮＡ 聚合酶、１０×Ｔａｑ缓冲 液、三磷 酸 碱 基 脱 氧 核 苷 酸 （ｄＮＴＰｓ）、细 菌 基 因 组 ＤＮＡ 提取试剂盒、ＤＮＡ 胶回收试剂盒、１００ｂｐ分子 标记物、１ｋｂ分子标记物，均购自天根生化科技有限 公司；ＬＢ肉汤培养基购自杭州天和微生物试剂有限 公司；低温高速离心机和ＰＣＲ扩增仪为Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司产品；电泳仪为北京六一仪器厂产品；生物安全柜 为 Ｔｈｅｒｍｏ公司产品；Ｇｅｎｅｇｅｎｉｕｓ紫外凝胶成像分析 系统为基因公司产品。ＰＣＲ 引物为ｒｐｓＬ 管家基因， 参考 ｗｗｗ．ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｃｏｍ／（ＩＤ：ＰＡ４２６８）上 的 ｒｐｓＬ基因序列自行设计，所有引物委托Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公 司合成。见表１。

１．３ 方法

采用 ＰＣＲ检测４种氨基糖苷类修饰酶基 因ａｎｔ（２″）－Ⅰ、ａｎｔ（３″）－Ⅰ、ａｎｃ（６′）－Ⅰ和ａｎｃ（６′）－Ⅱ。

１．３．１ 细菌

ＤＮＡ 提取 用接种环挑取纯菌落接种 于５ｍＬ的 ＬＢ肉汤培养液，将装有 ＬＢ肉汤培养液的 试管置于电热恒温培养箱中，３７ ℃，２００ｒ／ｍｉｎ，１８～２０ｈ 培养至细菌生长对数期。然后取３ｍＬ 培养液，按照 天根生化科技有限公司的细菌基因组 ＤＮＡ 提取试剂 盒操作说明进行操作，提取的 ＤＮＡ 模板置于－２０ ℃ 保存备用。

１．３．２ ＰＣＲ 检测修饰酶基因

ＰＣＲ 反应体系设置 参照天根公司 ＴａｑＤＮＡ 聚合酶说明：模板１．５μＬ，正 向引物（ｐｒｉｍｅｒ－Ｆ）０．５μＬ，反向引物（ｐｒｉｍｅｒ－Ｒ）０．５μＬ， １０×Ｔａｑ缓冲液２．５μＬ，ｄＮＴＰ混合物２μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶０．５μＬ，双蒸水（ｄｄＨ２Ｏ）补至２５μＬ。ＰＣＲ反应 循环：９４℃、４ｍｉｎ，９４℃、３０ｓ，５５ ℃、３０ｓ，７２ ℃、４０ｓ （３０个循环）；７２ ℃、４ ｍｉｎ。ＰＣＲ 产物电泳分析：取 ５μＬ扩增产物与 １μＬ６× 上样缓冲液混匀，点样于 １％琼脂糖凝胶，在１２０Ｖ 电压下电泳３０ｍｉｎ；出现条 带后，用凝胶成像系统观察条带并照相。阳性产物送 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序，所得测序结果在 ＧｅｎＢａｎｋ数据 库进行同源性比对。

１．４ 统计学处理

采用 ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０对数据 进行整理。

2 基因和 ａｎｃ（６′）－Ⅱ 基因

未检测出 ａｎｔ（３″）－Ⅰ 和 ａｎｃ （６′）－Ⅰ基因。ＰＣＲ 阳性产物随机各选取 １ 例送Ｉｎ－ ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序，测序结果在 ＧｅｎＢａｎｋ进行同源性 比对，比 对 结 果 显 示，ａｎｔ（２″）－Ｉ 基 因 和 登 录 号 为 ＣＰ０３３１３１．１和 ＣＰ０２９０９０．１的ａｎｔ（２″）－Ⅰ基因同源 性为１００％，ａｎｃ（６′）－Ⅱ基因与登录号为 ＣＰ０３６２９４．１ 的铜绿假单胞菌的ａｎｃ（６′）－Ⅱ基因同源性为１００％。结 果 　　所有菌株均能扩增出ｒｐｓＬ基因条带。６０ 株多重耐药铜绿假单胞菌中检测到含有氨基糖苷类 修饰酶基因的菌株共１６株，检出率为 ２６．６７％（１６／ ６０）。８株含 ａｎｔ（２″）－Ⅰ 基因，检出率为 １３．３３％（８／ ６０），见 图 ２。１０ 株 含 有 ａｎｃ（６′）－Ⅱ 基 因，检 出 率 为 １６．６７％（１０／６０）；其中两株同时含ａｎｔ（２″）－Ⅰ基因和 ａｎｃ（６′）－Ⅱ 基因，未检测出 ａｎｔ（３″）－Ⅰ 和 ａｎｃ （６′）－Ⅰ基因。ＰＣＲ 阳性产物随机各选取 １ 例送Ｉｎ－ ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序，测序结果在 ＧｅｎＢａｎｋ进行同源性 比对，比 对 结 果 显 示，ａｎｔ（２″）－Ｉ 基 因 和 登 录 号 为 ＣＰ０３３１３１．１和 ＣＰ０２９０９０．１的ａｎｔ（２″）－Ⅰ基因同源 性为１００％，ａｎｃ（６′）－Ⅱ基因与登录号为 ＣＰ０３６２９４．１ 的铜绿假单胞菌的ａｎｃ（６′）－Ⅱ基因同源性为１００％。

3 讨 论 　　

近年来，氨基糖苷类药物的广泛使用导致细菌对 其耐药的现象越来越严重，这种现象在ＩＣＵ 中表现得 尤为突出。细菌对氨基糖苷类药物的耐药性主要 取决于氨基糖苷类药物修饰酶，氨基糖苷类药物修饰 酶主 要 有 Ｎ－乙 酰 转 移 酶 （ＡＡＣ）、Ｏ－核 苷 转 移 酶 （ＡＮＴ）等，它主要通过共价修饰的方式使氨基糖苷类 药物与核糖体的结合减少，促进药物摄取能量依赖期 阶段二（ＥＤＰ－Ⅱ）也被阻断，从而导致耐药。ＡＡＣ 可以催化氨基糖苷类抗菌药物１、３、６′和２′位点氨基 的乙酰化反应，其中ａｎｃ（６′）－Ⅰ主要与阿米卡星的耐 药相关，ａｎｃ（６′）－Ⅱ与庆大霉素和妥布霉素的耐药相 关。ＡＮＴ 的作用主要是使氨基糖苷类抗菌药物腺 苷化而失活，其中ａｎｔ（２″）－Ⅰ可使庆大霉素和妥布霉 素失活，但对奈替米星无修饰作用；ａｎｔ（３″）－Ⅰ与链霉 素的耐药有关。