胜红蓟精油复合微乳液体系搭建

芦柑( Citrus reticulate Blanc Ponkan) 属芸香科柑 橘属植物，其果实硕大，肉质脆嫩，汁多化渣，但果实在 采后、运输贮藏及货架期极易感染绿霉病和青霉病，导 致其感染的腐败真菌菌种主要是意大利青霉 ( Penicillium italicum ) 和 指 状 青 霉 ( Penicillium digitatum ) 。 此 外， 扩 展 青 霉 ( Penicillium expansum) 也能导致青霉病发生，其侵染果实后分泌的 展青霉素是一种神经性真菌毒素，不仅会对食用者造 成潜在的危害，而且还会严重影响农业经济效益。 目前，芦柑市场所用的保鲜剂可以抑制绿霉和青霉病， 但是化学保鲜剂不仅会危害人体健康而且会污染环 境; 物理保鲜剂往往需投入一定的设备成本; 生物 保鲜技术受外界环境影响较大。其中，植物精油 作为一种极具潜力的天然杀菌剂，不仅能有效抑菌而且可以增强芦柑果实保鲜效果，是化学保鲜剂的良 好替代品。胜红蓟( Ageratum conyzoides L．) 是一种 外来入侵植物，属于区域性恶性杂草，其入侵农田 后会造成农作物减产，给生态环境和人体健康带来危 害。研究表明，胜红蓟精油主要成分为氧萘烯类物质， 如早熟素和石竹烯等，对多种真菌具有抑制作 用。宁蕾等研究发现胜红蓟精油对香蕉炭疽 病菌( Glorosprium musarum Cookeet Mass) 和柿角斑病 菌( Cercospora kaki Ell． et Ev．) 抑菌率高达 100%。

采摘福建永春果园中 福建芦柑作为试验材料。挑选成熟度一致、无病虫害、 无机械损伤、直径为 65 ～ 75 mm 的果实。供试菌种为 意大利青霉( P． italicum) 、指状青霉( P． digitatum) 和 扩展青霉( P． expansum) ，由华中农业大学和中国农业 科学院柑橘研究所提供。 孢子悬浮液的制备: 用无菌水将培养在马铃薯葡 萄糖琼脂( potato dextrose agar，PDA) 培养基斜面上的 意大利青霉、扩展青霉和指状青霉孢子分别洗下，用血 球计数板将孢子浓度用无菌水调整到 106 CFU·mL－1 ， 得孢子悬浮液。再将各孢子悬浮液取等量的体积混合 均匀，即得混合菌孢子悬浮液。 吐温－80( 汕头市西陇化工有限公司) 、碳酸钠( 西 陇化工股份有限公司) 、无水乙醇( 国药集团化学有限 公司) 、次氯酸钠( 西陇科学股份有限公司) 均为分析 纯; 羧甲基壳聚糖购自浙江澳兴生物科技有限公司; 咪 鲜胺购自黑龙江省佳木斯黑龙农药化工股份有限公 司; 马铃薯葡萄糖琼脂培养基购自广东环凯微生物有 限公司；生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司。

采用超声波辅助水蒸气蒸馏法提取胜红蓟精油，工艺条件: 超声功率 120W、超声时间 30 min、料液比 1 ∶20 和粉末粒度 40 目。按照不同质量比( 1 ∶1、1 ∶2和 1 ∶3) 将胜红蓟精油与无水乙醇混合均匀作为油相，添加不 同浓度的碳酸钠、羧甲基壳聚糖作为水相，油相与表面 活性剂吐温－80 按不同的质量比( 10 ∶0、9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、 6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8、1 ∶9 和 0 ∶10) 混合均匀，向上述 混合溶液中逐渐加入水相，观察体系的状态变化。当 体系由澄清变为浑浊，或由浑浊变为澄清状态时，记录 变化时的临界加水相量，采用 Origin 9. 0 软件绘制拟 三元相图———多相区( 体系呈乳白色浑浊态) 、单相区( 即微乳液，呈均匀透明状) 及液晶区( 呈半凝固均一 状) 。在拟三元相图中利用单相区面积( AT ) 来评价各 成分的增溶能力，用动态激光粒度分析仪测定溶液粒 径，筛选最佳微乳液体系配方。

本研究选用吐温－80 作为表面活性剂，以乙醇为 助表面活性剂，以碳酸钠和羧甲基壳聚糖为水相，利用 拟三元相图确定最终的微乳液体系，结果见图 1。加 入不同比例的乙醇考察其对微乳体系相行为的影响 ( 图 1-A) 。当胜红蓟精油与乙醇的质量比为 1 ∶1，形 成的单相区面积 AT 为 66. 04%; 随着胜红蓟精油与乙 醇的质量比提高到 1 ∶3，微乳液体系单相区面积增加 至 85. 59%，故选择胜红蓟精油与乙醇的质量比为 1 ∶3 进行后续试验。加入不同浓度的碳酸钠考察其对微乳 体系相行为的影响( 图 1-B) 。3%碳酸钠溶液形成最 大的单相区面积 AT 为 93. 22%，而 5%碳酸钠溶液形 成的单相区面积 AT 下降至 59. 35%，故选择 3%碳酸 钠进行后续试验。加入不同浓度的羧甲基壳聚糖考察 其对微乳体系相行为的影响( 图 1-C) 。随着羧甲基壳 聚糖溶液浓度增加，形成的微乳液单相区面积 AT 逐 渐减小，由 84. 63%下降至 14. 99%，故确定 0. 5%羧甲 基壳聚糖进行后续试验。 不同比例的 3%碳酸钠和 0. 5%羧甲基壳聚糖溶 液作为水相对微乳体系相行为的影响( 图 1-D) 。3% 碳酸钠和 0. 5%羧甲基壳聚糖比例为 1 ∶3时，能形成较 大的单相区，且当油相与吐温－80 的比例为 1 ∶1 时，存 在无限稀释线，而 3%碳酸钠和 0. 5%羧甲基壳聚糖比 例为 1 ∶1和 3 ∶ 1 时，形成的单相区面积减少，故选择 3%碳酸钠和 0. 5%羧甲基壳聚糖比例为 1 ∶3时的相图 作为最终的复合微乳液体系。

在三相图内，空白区域为单相区，即为微乳液区。 在微乳液区域选取无限稀释线，即稀释线上对应的点 表示的各组分在此比例下均能形成微乳液。针对筛选 出的复合微乳液相图，选取最高的一条无限稀 释线，即 L55。此时，精油 ∶乙醇 = 1 ∶3作为油相，油相 ∶ 吐温－80 = 1 ∶1，3%碳酸钠 ∶0. 5%的羧甲基壳聚糖= 1 ∶3 作为水相，测定这条稀释通道上随着水相的增加其纳 米粒径的变化情况。A60、A70、A80和 A90体 系微乳液粒径分别为 59. 68、51. 28、34. 47、91. 81 nm， 均小于 100 nm，符合微乳液粒径在 1 ～ 100 nm 之间的 定义。A80体系的多分散系数( polymer dispersity index， PDI) 值为 0. 530，说明胜红蓟精油、吐温－80、乙醇、碳 酸钠和羧甲基壳聚糖等成分形成的微乳液体系分散性 好。因此，选取 A80体系的微乳液进行后续研究。

复合微乳液 A80能有效抑制意大利青霉、指状青 霉和扩展青霉的生长，20 mg·mL－1 复合微乳液 A80与冷 藏( 4℃ ) 保鲜结合能有效降低贮藏期间芦柑果实的失 重率和腐烂率，这与 Ｒaid 等利用橘皮精油微乳液 延长鲜切橙的货架期效果相似。其主要原因可能是胜 红蓟精油作为植物天然抑菌物质，含有一些生物 活性成分，如挥发性的单萜、倍半萜和柠檬苦素、类黄 酮等，这些活性成分具有抑菌作用。且加入的乙 醇、3%碳酸钠溶液及 0. 5%羧甲基壳聚糖，使得本研究 构建的复合微乳液增溶能力增强，延长了对芦柑的保 鲜效果。同时，精油与乙醇的质量比为 1 ∶3时，有较好的增溶效果，说明加入短链醇乙醇能明显降低界面膜 的弯曲系数，一定范围内，随着乙醇浓度的增加，微乳 液的增溶能力增强，这与 Chen 等的研究结论一致。 选取 3%碳酸钠作为水相，是因为一定浓度的盐溶液 能提高表面活性剂的亲水性能，但是过高浓度的盐溶 液会导致非离子型表面活性剂( 吐温－80) 产生盐析作 用，盐析作用聚集到一定程度后会造成微乳液体系产 生浑 浊，形 成 多 相 区，这也验证了前人的研究结论。选取 0. 5%羧甲基壳聚糖作为水相是由于高 浓度羧甲基壳聚糖分子间存在极强的氢键作用而相互 缠绕，使得能进入界面膜的羧甲基壳聚糖分子减少，会 造成增溶能力减弱。