好氧反硝化菌种的复苏培育剖析

藤黄球菌( Micrococcus luteus) 所分泌的复苏促进因子( resuscitation-promoting factor，Rpf) 的发 现被认为是复苏培养 VBNC 状态菌最重要的突 破。Rpf 在皮摩尔浓度下即可使自身处于 VBNC 状态的细胞复活，并使可培养数量增长至 100 倍 以上，且可促进细胞的生长。研究发现制药废 水中对 Rpf 敏感的 VBNC 优势菌群主要有革兰氏 阳 性 ( G+ ) 菌 如 Microbacterium、Gordonia 和 Leucobacter 属 等，及 革 兰 氏 阴 性 ( G－ ) 菌 如 Candidimonas、Xanthobacter 和 Aminobacter 属 等。

高氨氮废水取自浙江省金华市某工业污水处 理厂，其 COD 为 500 mg /L，NH+ 4-N 为 420 mg /L， NO－ 2-N 未检出，NO－ 3-N 为 10 mg /L，pH 值为 7. 2。 1. 2 仪器 紫外分光光度计( UV-7504，上海欣茂仪器有限公司) ; 恒温培养振荡器( ZHWY-100C 上海智 诚仪 器 分 析 制 造 公 司) ; 台 式 离 心 机 ( 5417R， Eppendorf) ; 恒温恒湿培养箱( HWS-350，宁波海 曙塞富实验仪器厂) ; 电子天平( JY3002，上海精密科学仪器有限公司 ) ; 移 液 枪 ( P500， Eppendorf) ; 电热鼓风干燥箱( DHG-9070A，上海精宏实验设备有限公司) 。

将 M． luteus 的 rpf 基因克隆在 Escherichia coli BL21 ( DE3) 中诱导表达，经纯化后获得 Rpf 蛋白。 具体步骤简述如下: 将 质 粒 转 化 的 Escherichia coli BL21( DE3) 接种至含有 50 mg /L 相应抗生素的 LB 液体培养基中，37 ℃，120 r/min 培养至对数生长期，然后再接种至 200 mL SOB 培 养基中扩大培养，确认转化细菌浓度为 OD600 = 0. 6 时，加入 IPTG 诱导剂至终浓度为 1 mmol /L， 20 ℃，120 r/min 诱导过夜。 离心( 12 000 r/min，10 min) 收集细胞，加入 缓冲液重悬菌体，并超声破碎使得蛋白释放出来。 经 Ni 柱吸附，100 mmol /L 的咪锉洗脱液洗脱后， 再利用纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化。提纯的 Rpf 蛋白经 0. 22 μL 微孔滤膜过滤后，加甘油至终 浓度为 50%，置于－20 ℃ 保存备用。同时，将 Rpf 蛋白高压灭活( 121 ℃，20 min) 用于对照组的实 验研究。

VBNC 菌的复苏促进作用 MPN 培养体系中，吸取 1 mL 采自于污水处 理厂的高氨氮废水加入至 9 mL LB 液体培养基 中，而后依次稀释，连续设置 10 个稀释梯度，每一个梯度设立 3 个平行。在各处理组稀释液均 添加 0. 25% Rpf 蛋 白，对照组各稀释 液添加 0. 25%无活 性 Rpf 蛋 白 上 清 液，将 样 品 放 置 在 30 ℃ ，120 r/min培养体系中生长。通过测定处理 组与对照组培养液菌体密度( OD600 ) 来反映 Rpf 对菌体生长状况的影响。同时记录样品的浊度以 获得 MPN 值，利用 MPN 表计算出每个样品中可 培养细菌的总数。 当细菌总数处于稳定，将处理组与对照组培 养液最大稀释度分别涂布于固体平板中获得可培 养细菌。对比两组涂布平板的菌落差异，仅存在 于处理组的菌株则为对 Rpf 蛋白敏感的 VBNC 菌。将纯化后的的菌株扩大培养并收集至 10% 的甘油中，－80 ℃ 保存。每种稀释度的剩余培养 液则放至－20 ℃保存备用。

基因经克隆，并在 Escherichia coli BL21 ( DE3) 中诱导表达及系列纯化后，获得 Rpf 重组蛋白。结果如图 1 所示，由 SDS-PAGE 图可 知，蛋白洗脱液中含有清晰的目的条带，重组蛋白 的分子量约为 23 kDa，且杂条带数量相较于粗体 液明显减少，说明经 Ni 柱洗脱后得到了纯度较高 的 Rpf 蛋白。 本研究中所获的重组蛋白的分子量相对于 Mukamolova 等从藤黄球菌上清液中分离提取的 Rpf 蛋白( 16～17 kDa) 偏大，其原因为此重组蛋白 未去除 N 端的 6 个 His 标签。同时，与 Mukamolova 等所获的重组蛋白分子量( 25 kDa) 相当。每隔 24 h 记录 MPN 培养体系中处理组和对 照组在 600 nm 处的光密度值。当数值趋于稳定 后，读取 MPN 值。在培养体系中，处理组最后 3 个稀释度分别有 3 个，3 个和 2 个浑浊管，对照组 分别有 3 个，3 个和 1 个浑浊管，透明管意味着其 OD600值接近于 0。在各稀释度中，处理组的菌体 生长量均大于对照组，尤其是在最后的稀释度中，这表明 Rpf 可促进细菌的生长。

1) 本研究表明高氨氮废水中存在大量对 Rpf 敏感的 VBNC 细菌，其数量占总菌数的 58. 1%。 并分离纯化 4 株 VBNC 菌株，其中 ZYR51 归属于 Gordonia 属，菌 株 CHZYN52、CHZYR61 和 CHZYR63 均归属于 Pseudomonas 属。

2) 本研究表明 Pseudomonas 和 Gordonia 属可 能为高氨氮废水中存在的主要 VBNC 功能菌群， 经 Rpf 复苏后具有较好的好氧反硝化性能。

3) 本研究揭示在高氨氮废水中，与藤黄球菌 具有较好亲缘关系的 Gordonia 属菌株 ZYR51 的 脱氮性能最强。从而为挖掘高效好氧反硝化菌提 供新的思路。