培养箱在大豆磷酯微生物限度检查办法适用性

本试验的目的是为了确认所采用的中国药典 2015 年版四部和 2015 年版第一增补本四部 中的微生物限度检查方法适用于大豆磷酯需氧菌进行适用性试验，满足药典规定的检验要求。

隔水式恒温培养箱；生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；立式压力蒸汽灭菌器；鼓风干燥箱；生物安全柜；电 冰箱。

金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉，大肠埃希菌。 菌种来源均为中国食品药品检定研究院，菌种代数依次为第三代，第三代，第五代，第三代， 第三代，第三代。

胰酪大豆胨琼脂培养基；沙氏葡萄糖琼脂培养基；胰蛋白胨大豆肉汤培养基；麦康凯肉 汤培养基，麦康凯琼脂培养基，pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液。

器具 锥形瓶；无菌刻度吸管；无菌培养皿；无菌试管；剪刀；接种环；酒精灯。

取金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌的新鲜培养物适量，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别制成含菌数约为 103～104 cfu/ml 的菌悬液备用。 取黑曲霉的新鲜培养物，加入 5ml 含 0.05%（ml/ml）吐温 80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白 胨缓冲液，将孢子洗脱，洗脱液经灭菌的脱脂棉过滤后，用胶头滴管吸入至经灭菌的试管内， 用含 0.05%（ml/ml）吐温 80 的 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成含菌数约为 103～ 104 cfu/ml 的菌悬液备用，24 小时内使用。 取大肠埃希菌的新鲜培养物适量，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成含菌数约为103～104 cfu/ml 的菌悬液备用。

取供试品 10g，加 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100ml，使供试品分散均匀，制成 1：10 供试液。

取上述制备好的 1：10 供试液 9.9ml 5 支，分别加入金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌， 枯草芽孢杆菌，白色念珠菌和黑曲霉 0.1ml（含菌量约为 103～104 cfu/ml），混匀。分别取 1ml 注入无菌平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，倒置培养。按平皿倾注法测定其菌落 数，同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

适用性试验（平皿法） 取上述制备好的 1：10 供试液 9.9ml 2 支，分别加入白色念珠菌和黑曲霉 0.1ml（含菌 量约为 103～104 cfu/ml），混匀。分别取 1ml 注入无菌平皿中，倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基， 混匀，倒置培养。按平皿倾注法测定其菌落数，同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

试验组：分别按上述菌落计数方法进行试验组菌落的计数。 菌液对照组：以稀释液代替供试品溶液，按照试验组的菌落计数方法试验。 供试品对照组：按菌落计数方法，不加试验菌，测定供试品本底菌落数。 阴性对照试验：用刻度吸管吸取稀释液 1ml 置直径 90mm 的无菌平皿中,注入 15～20ml 熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，倒置培养。阴性对照试验应 无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 培养条件：需氧菌总数计数方法适用性试验时，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草 芽孢杆菌培养温度为30～35℃，培养时间3～5天；白色念珠菌和黑曲霉培养温度为30～35℃， 培养时间 5 天。霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验时，白色念珠菌和黑曲霉培养温度为 20～25℃，培养时间 5 天。结果见表 1，表 2。 结果判断：

回收率：应在 0.5～2 范围内。

适用性试验 试验组：取 1:10 供试液 10ml，接种到 100ml 胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，加入大肠埃 希菌 1ml，（含菌量为 10～102 cfu/ml），混匀， 30～35℃培养 18 小时，应检出相应的控制菌。 阳性对照试验：取稀释剂 10ml，接种至 100ml 胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，加入大肠埃 希菌 1ml，（含菌量为 10～102 cfu/ml），混匀， 30～35℃培养 18 小时，应检出相应的控制菌。 阴性对照试验：取稀释液 10ml 接种至 100ml 胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，混匀， 30～ 35℃培养 18 小时，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。 选择和分离培养：分别取上述培养物 1ml 接种至 100ml 麦康凯肉汤培养基中，42～44℃ 培养 24 小时。 取麦康凯肉汤培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上, 30～35℃培养 18 小时。 上述试验组若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未 检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性并重新进行方法适用性试验。

适用性试验，霉菌和酵母菌总数计数方法适用性试验和控制 菌检查方法适用性试验，分别要进行三次试验。结果见表 3。

3 结论

由以上对大豆磷酯需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数和控制菌方法适用性试验可以看 出，按平皿法（1：10）对金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌和黑 曲霉总数测定的回收率在 0.5～2 范围内，确定此法适用于本品需氧菌总数测定。按平皿法（1： 10）对白色念珠菌和黑曲霉总数测定的回收率在 0.5～2 范围内，确定此法适用于本品霉菌和 酵母菌总数测定。按常规法进行大肠埃希菌检验，试验组和阳性对照组菌生长良好，阴性对 照均无菌生长，确定此法适用于本品大肠埃希菌检验。