分析仪在发酵豆酱的微生物群落结构分析中

豆酱是以大豆为主要原料，利用微生物经过自然发 酵制成的半流动状态的发酵食品。不同发酵方法生产的 豆酱产品质量不同。Kim等通过使用聚合酶链式反应变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）研究了10 个 豆酱样品的微生物多样性，结果发现不同样本的群落结 构存在一定差异。Zhu Linjiang等通过研究蚕豆酱在传 统发酵过程中的微生物群落，揭示了微生物群落结构对 发酵过程中风味物质产生的影响。因此，分析不同地区 传统豆酱的微生物多样性对于了解产品质量至关重要。 Namgung等通过主成分分析发现，氨基酸可能与口感、 风味、营养和生理活性有关。康旭等对豆酱中氨基酸 与挥发性物质的关系分析表明，氨基酸种类与豆酱风味 物质有一定的相关性，酸性氨基酸会增加豆酱的鲜味， 中性氨基酸可能产生丁香味的风味物质，碱性氨基酸对 风味影响较小。可见，氨基酸对豆酱产品质量起着重要 作用。基于以上微生物群落结构与游离氨基酸对豆酱质 量的影响，本实验采用高通量测序技术和氨基酸分析技 术研究不同地区豆酱产品的质量，采用偏最小二乘回归 （partial least-squares regression，PLSR）模型分析豆酱微 生物多样性和游离氨基酸组成的相关性，寻找几种不同 豆酱产品质量差异的原因，并为将来企业提高产品质量 提供理论依据。本实验具体分析得到豆酱中游离氨基酸 的组成以及豆酱中微生物结构组成的关系，并明确东北 地区质量较好的豆酱产品。

发酵豆酱样品，从黑龙江省黑河、黑龙江省宝泉岭、黑龙江省桦南和吉林省长春4 个地区采集新鲜的 传统发酵豆酱样品（分别为HeiH、BaoQL、HuaN、 ChangC）。采集的样品经无菌容器密封后低温保藏运 输，在实验室－80 ℃保存。 DNA提取试剂盒、PCR扩增的全套试剂及扩增引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

GeneAmp PCR System 9700 郑州杜甫仪器厂； Power Pac Universal水平电泳仪 北京普析通用仪器有 限责任公司；Gel DOCXR凝胶成像系统、日立L8800氨基 酸自动分析仪 上海精宏实验设备有限公司。

（quantitative descriptive analysis， QDA）法评价豆酱样品的质量 QDA是一种以描述性分析为主的对样品进行感官评 定的方法，利用多元统计方法分析获得数据，对样品进 行定性和定量相结合的分析。具体分析过程为：首先挑 选评定员组成定量描述分析小组，提出并挑选能反映样 品感官特性的描述词汇，然后采用线性标度对其进行评 价打分，打分结束后进行统计分析，用雷达图直观表示 对测定样品的质量评价。本研究挑选10 名评定员，从色 泽、香气、滋味和体态4 个方面对不同地区的发酵豆酱样 品进行质量评价，评价结果采用QDA图表示。

提取每个样品总DNA，检验合格后，利用引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对细 菌的16S rDNA的V3-V4区域扩增。利用引物ITS1F （5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS2R （5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）对真菌ITS的ITS1区域扩增。PCR扩增及测序工作由上海美吉生物医 药科技有限公司。

称取1 g豆酱样品，加10 mL 6 mol/L盐酸溶液于水解 管中，混匀，充氮并迅速封口，110 ℃水解22～24 h， 冷却后过滤，滤液真空浓缩至干，重复1～2 次。加入 5 mL pH 2.2柠檬酸钠缓冲液，滤膜过滤后利用氨基酸自 动分析仪测定。

采用SPSS 20.0软件，对样品中氨基酸进行主成分分 析和综合性评价。用Simca14.1软件以PLSR建立模型， 分析微生物菌群结构与游离氨基酸之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 发酵豆酱产品质量评价

由表1和图1可知，4 种豆酱在4 个感官特性强度上差 异较大，尤其样品BaoQL在4 个感官特性强度上都较强， 而样品HeiH在香气、滋味、体态感官特性强度上都较 弱。BaoQL综合评分最高，HeiH综合评分最低。

采用FLASH、Trimmomatic软件处理原始数据，将 获得的所有序列进行OTU分类。由表1可知，4 份样品的 细菌OTU总数为238，平均数为60，最大值为70，最小值 为47。4 份样品的真菌OTU总数为254，平均数为64，最大值为70，最小值为53，由此可以看出，4 份样品中真菌 的OTU数比细菌的OTU数大，真菌的物种丰富度较大。

在Rank-Abundance曲线中，OTU等级代表系统群落 物种的丰度，OTU等级越高，表示系统里物种越丰富。 OTU曲线越平滑，表示系统里物种越均匀。由图2a可 知，BaoQL的细菌物种丰度最高，物种数量分布也最均 匀，ChangC的次之；由图2b可知，HeiH的真菌物种丰度 最高，BaoQL次之；真菌物种数量分布上，BaoQL更加 均匀，这可能与两个地区的纬度差异和气候不同有关。

OTU分析后，分别计算各Alpha多样性指数。由表2 可知，4 份豆酱样品细菌的Chao l指数平均值为75.19， ACE指数平均值为75.00，Shannon指数平均值为1.58。 4 份豆酱样品真菌的Chao l指数平均值为26，ACE指数 平均值为30.60，Shannon指数平均值为0.83。从Chao l和 ACE指数可以看出，豆酱样品的细菌菌群丰度高于真菌 菌群丰度。从Shannon指数可以看出，豆酱样品的细菌物 种均匀度高于真菌物种均匀度。因此，传统豆酱中细菌 菌群多样性更加丰富。

QDA可知，4 种发酵豆酱中，黑龙江省宝泉岭的豆 酱产品质量最优。黑龙江省宝泉岭豆酱中游离氨基酸种 类和总质量浓度最高，因此，游离氨基酸种类和总质量 浓度对产品质量的影响至关重要。这与武俊瑞等在豆 酱中氨基酸的种类和数量决定豆酱品质中的结论和Lin Hongbin等得出氨基酸有望用于评价和代表郫县蚕豆酱 的风味品质的结论一致。 豆酱中游离氨基酸的组成和含量与发酵过程中微生 物群落结构有很大关系，细菌中Weissella对游离氨基酸的 种类和含量影响最大，真菌中Millerozyma和Aspergillus对 游离氨基酸的种类和含量影响最大；细菌菌群对游离氨 基酸种类和含量的影响显著高于真菌菌群。黑龙江省宝 泉岭豆酱样品的质量明显好于其他3 个样品，主要因为黑 龙江省宝泉岭豆酱中含有上述几种优势菌群，导致氨基 酸种类和含量均高于其他样品，这与Kim等研究的韩国 发酵大豆酱微生物群落与豆酱的感官属性密切相关和Li Zhihua等研究的中国传统红辣椒豆瓣酱中细菌群落和 挥发性化合物之间高度协变关系的结论一致。 微生物发酵产品质量与其微生物多样性的关系， 近年来已经引起国内外研究者的高度关注。Lee等通 过对豆酱的微生物多样性与代谢组学进行相关性分析 表明，鲁氏接合酵母和四联球菌属与氨基酸代谢、曲 霉属与糖代谢、芽孢杆菌属与脂肪酸代谢都有显著相 关。Li Zhihua等分别通过对豆酱中的细菌多样性和 代谢产物进行相关性分析，得到假单胞菌与含氮代谢物 显著相关，链球菌属与含碳代谢物等显著相关。因此， 还需要进一步分析豆酱中微生物多样性与其他代谢产物 之间的相互关系，为发酵豆酱产品质量提供更全面的 理论依据。