跨膜蛋白ESDN的表达与血管内膜増生的初步研究

内皮和平滑肌细胞来源的neuropilin样分子(endothelialandsmoothmusclecell-derivedneuropilin-likemolecule,ESDN)是一类Ⅰ型跨膜蛋白,其分子内含有一个CUB结构域､一个LCCL结构域和一个凝血因子Ⅴ/Ⅷ同源结构,与neuropilins结构相似,而neuropilins可以调控多种生长因子受体的信号途径,推测ESDN可能具有类似的功能｡越来越多的研究表明,ESDN在调节血管细胞生长方面起着重要作用｡Nie等研究发现,ESDN能够通过调节血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)信号途径进而诱导血管内皮细胞增殖､迁移过程,从而促进血管生成;在离体培养的血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell,VSMC)中,处于增殖状态时ESDN表达显著高于生长抑制的细胞,而ESDN的过度表达则抑制VSMC生长,其分子机制可能与ESDN对血小板衍生因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)及其受体调控有关｡VEGF和PDGF作为一类强效促有丝分裂剂,是介导VSMC增殖和内膜增生的关键因素｡ESDN能够调控这2种生长因子的信号途径,表明ESDN的表达可能与血管增生密切相关｡血管增生是动脉粥样硬化､高血压､血管成形术后再狭窄等心血管疾病中普遍存在的病理生理表现｡其主要特征表现为血管损伤后,位于血管中膜的呈收缩表型的VSMC出现表型转化,转变为合成表型,增殖并迁移至内膜从而导致的一种血管重构现象｡为进一步研究ESDN表达与血管增生的关系,本研究利用本室保存的Esdn基因敲除小鼠及野生型小鼠构建颈总动脉结扎血管内膜增生模型,比较结扎后不同时间Esdn基因敲除(Esdn-/-)小鼠与野生型小鼠血管内膜增生情况,观察Esdn-/-小鼠及野生型小鼠VSMC分化表型标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(smoothmuscleα-actin,SMα-actin)和SM22α,以及VSMC增殖表型标志蛋白———骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在血管组织中的表达差异变化｡通过探究ESDN表达与血管重构的关系,进一步阐明ESDN的表达在VSMC生物学功能改变中的重要作用,这将有助于加深对血管炎性疾病的病理生理过程的理解,可为心血管疾病的防治和癌症控制提供有力武器,并为 临床诊断､治疗血管炎性疾病提供新思路。

Esdn-/- 小 鼠 与 野 生 型 小 鼠,8~12 周 龄,来 自 Dr.MehranSadeghi(Yale University)馈 赠,保 存､繁 育 并 饲 养 于 SPF 级 动 物 房,IVC系统,清洁饮水,自由取食｡环境采用12h 明暗循环,早7:00至晚7:00照明,晚7:00至次日 早7:00无照明｡所有动物实验均按照河北医科大 学动物管理条例进行,实验过程对动物的处置符合 动物伦理学 要 求｡本 研 究 所 用 SM α-actin兔 多 克 隆抗体(ab5694)､SM22α抗 体 (ab14106)､OPN 兔 多克隆抗体(ab8448)购 自 Abcam 公 司(1∶1000稀 释),β-Actin 兔 单 克 隆 抗 体 (4970)购 自 Cell signaling公司(1∶1000稀 释),抗 兔 Alexa488免 疫 荧光二 抗 购 自Invitrogen公 司(A-11034,1∶200稀 释)

FRESCO17低温离心机(Thermo 公司),KA-1000低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂), 激光共聚焦显微镜(Leica公司),电泳仪､半干式蛋白质印迹转膜槽和发光显影仪(Bio-Rad公司)。

建立小鼠颈总动脉结扎血管内膜增生模型,术后将Esdn-/- 小鼠､ 野生型分别随机分为结扎术后3,7,14,21d组和假 手术组(只分离血管,不结扎),每组6只｡术后相应 时间处死小鼠,迅速分离结扎侧颈总动脉用于实验。

血管组织加入适量组织 裂解液 RIPAbuffer(150mmol/LNaCl,50mmol/ LTris-HCl,pH7.5,1% NP-40,0.5%脱氧胆酸钠, 0.1% SDS,1mmol/LEDTA,临用前加入complete proteinaseinhibitor(Roche Applied Sciences)和 phosphataseinhibitorcocktails (Sigma-Aldrich), 匀浆,离心分离上清,改良 Lowry法蛋白定量,取等量蛋白提取液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)｡ 电转 移 至 PVDF 膜 上,应 用 SM α-actin､SM22α和 OPN 孵育并与相应的二抗反应,化学发光法检测抗 原抗体结合区条带,用Image-J软件进行定量分析。

将冰冻切片置于预冷丙酮酸溶液中固定5min,TBS缓冲液洗涤3次,5min｡ 5%山羊血清封闭30min,随后加入抗体4 ℃湿盒过 夜,TBS缓冲液洗涤后加入荧光二抗,避光,室温30 min｡TBS缓冲液洗涤后,DAPI染核,80%甘油封片｡激光共聚焦显微镜观察和摄照。

应用 SPSS21.0统计软件分析数据｡计量资料比较分别采用两独立样本的t检验､F检验和SNK-q 检验｡P<0.05为差异有统计学意义。

ESDN是使用改良信号序列捕获技 术,从原代培养的人冠状动脉细胞和高转移性肺癌细胞中克隆 得到的一 种新型跨膜蛋 白｡Northern印 迹 研 究 表 明,ESDN 在人与胎儿的骨骼肌､胎 盘､心 脏､结 肠､ 卵巢和前列腺等组织广泛表达,尤其以成人睾丸表达量最高｡另外,ESDN 在成年大鼠迷走神经,小鼠 心脏､肺部､主动脉以及胚胎迷走神经和脑组织也高 表达｡本研究前期利用cDNA 芯片技术发现,正 常血管中Esdn､Vegfr-2及 Neuropilin-1均为低表 达,但它们在动脉粥样硬化血管和发生血管重构的 血 管 (remodelingartery)组 织 中 的 表 达 急 剧 升 高｡另外,ESDN 能 够 通 过 调 节 PDGF､VEGF 和表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)信 号途径参与血管再生及肿瘤发生发展等病理生理过程。