铜绿假单胞菌混合蛋白疫苗制备研究

铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa) 又称绿 脓杆菌，属于 γ－变形菌纲假单胞菌科，是一种在自然 界中广泛存在的条件性致病菌。铜绿假单胞菌 生存能力极强，能在各种环境中存活，并在机体免疫 功能低下或受损时引发感染，可引起人体烧伤或 创伤部位的伤口感染、中耳炎、角膜炎、肺炎甚至败血 症; 奶牛或奶羊乳房炎; 水貂出血性肺炎; 雏鸡败血症; 仔猪腹泻等疾病。近年来，铜绿假单胞菌抗 生素耐药问题日趋严重，因此疫苗研发再次成为国内 外学者研究的热点。2000 年，完成了铜绿假单 胞菌 PA01 菌株基因组测序，从而为认知该物种的复 杂性提供了帮助。

1 材料

1. 1 试验动物

清洁级 ICＲ 品系小白鼠 105 只，雌性，体重为 18 ～ 22 g; 清 洁 级 豚 鼠 15 只，雌 性，体 重 为 250 ～ 350 g; 均购自黑龙江省中医药大学实验动物中心。

1. 2 药品

0. 9%氯化钠注射液，购自哈尔滨三联药业股份有限公司。

1. 3 主要试剂

铜绿假单胞菌内毒素蛋白、类毒素( 由外毒素 A 脱毒制备) 、外膜蛋白样品及内毒素蛋白阳性血清、 类毒素阳性血清、外膜蛋白阳性血清和阴性血清，由 中国医学细菌保藏管理中心铜绿假单胞菌专业实验 室提供; PBST 缓冲液，购自上海莼试生物技术有限公 司; 牛血清白蛋白，购自盐城赛宝生物科技有限公司; 辣根过氧化物酶标记的SPA，购自上海科汇生物技术有限公司; 鲎试剂、细菌内毒素工作标准品、细菌内毒素检查用水，购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司; 硫 柳汞钠，购自上海信裕生物科技有限公司。

1. 4 主要仪器

生物安全柜( 型号为 CLASS Ⅱ TYPE A2) ，购自北京东联哈尔仪器制造有限公司; 电热恒温培养箱 ( 型号为 DNP－9082) ，购自上海精宏实验设备有限公 司; 独立送风隔离笼具( 型号为 IVC－II) ，购自苏州冯 氏实验动物设备有限公司; 多功能酶标仪( 型号为 Infinite M200 PＲO) ，购自瑞士 Tecan 公司。

2 方法

2. 1 内毒素蛋白、类毒素和外膜蛋白抗体效价的检测

取铜绿假单胞菌内毒素蛋白、类毒素和外膜蛋 白，在百级洁净条件下以 0. 9%氯化钠注射液分别制 备成 0. 4 mg /mL 的溶液，加入终浓度为 0. 01%的硫 柳汞钠，混合均匀后用 0. 22 μm 滤器过滤，分装成针 剂，4. 3 mL /安瓿。 取 32 只小白鼠，将其分成 4 组，每组 8 只，其中 3 组分别用上述 3 种蛋白针剂腹部皮下免疫小鼠，首 免 0. 1 mL，二免 0. 2 mL，三免 0. 3 mL，每次间隔 3 d。 剩余 1 组为 0. 9%氯化钠注射液对照组，免疫时间及 剂量与另 3 组相同。 免疫前小鼠断尾采血，首免后每间隔 7 d 采血， 共采血 7 次，4 ℃、4 000 r /min 离心 10 min 收集血 清。间接 ELISA 法测定血清抗体水平，参照殷州 的方法。1) 包被抗原 100 μL /孔，4 ℃ 过夜后弃去孔 内液体，用 pH 值 7. 4 PBST 洗涤 2 次，每次 5 min，在 滤纸上拍干; 0. 5% BSA 200 μL /孔封闭，37 ℃ 作用 1. 5 h; 用 pH 值为 7. 4 的 PBST 洗涤 3 次，每次 5 min， 在滤纸上拍干; 加血清 100 μL /孔，37 ℃ 作用 1 h，每 孔做 3 个重复，洗涤 3 次; 加辣根过氧化物酶标记的 SPA( 用 PBST 稀释) 100 μL /孔，37 ℃ 作用 1 h，洗涤 4 次。2) 加底物溶液 100 μL /孔，37 ℃ 反应 15 min; 加 2 mol /L 硫酸 100 μL /孔; 在 450 nm 波长处测定每 孔 OD 值。 按上述步骤建立的间接 ELISA 方法，对对照组 的8 份阴性血清进行检测，每份样品重复 3 孔，结果 取平均值，计算样品 OD450值，数据用“平均值±标准 差”表示。

2. 2 内毒素蛋白、类毒素和外膜蛋白内毒素含量的测定

按照《中华人民共和国药典》( 2015 年版) 中规 定的方法进行试验。

2. 2. 1 细菌内毒素限值的确定

细菌内毒素限值 ( L) = K/M，式中 K 为人每千克体重每小时最大可接受 的内毒素剂量，单位为 EU/( kg·h) ; M 为人每千克体重 每小时的最大供试品剂量，单位为 mg /( kg·h) 。《中华 人民共和国药典》( 2015 年版) 中规定，注射剂 K = 5 EU/( kg·h) ; 3 种蛋白每次最大注射剂量为 0. 12 mg， 人均 体 重 按 60 kg 计 算，注 射 时 间 为 1 min，M = 0. 12 mg /60 kg× 1/60 h = 0. 12 mg /( kg·h) ，则 L = 5 ［EU/( kg·h) ］/0. 12 ［mg /( kg·h) ］= 41. 67 EU/mg。

3 结果与分析

采用间接 ELISA 法检测 3 种蛋白免疫组和对照 组小鼠血清抗体水平，结果 3 种蛋白免疫后小鼠血清 抗体效价均随免疫进程持续升高，免疫组与对照组差 异显著( P＜0. 05) ，见表 1。


4 结论

铜绿假单胞菌内毒素蛋白免疫原性很好，但内毒 素含量略高，以其作为疫苗的主要成分会有一定的不 良反应; 外毒素 A 经甲醛脱毒而成的类毒素和外膜 蛋白的免疫原性也较好，且内毒素含量较低，因此本研究测定了内毒素蛋白、类毒素和外膜蛋白的免疫原 性和内毒素含量，制备了 5 组混合蛋白疫苗。研究表 明: 3 号混合蛋白疫苗的免疫效果与内毒素蛋白持 平，估计是 3 种抗原组分联合免疫后对机体的免疫系 统产生了协同效应，而且 3 号混合蛋白疫苗内毒素含量低于内毒素蛋白，有希望成为一种免疫效果好、不 良反应少的铜绿假单胞菌疫苗。