猪卵泡颗粒细胞表型分析！！！

    探讨干扰和过表达ＢＡＭＢＩ基 因对猪卵泡颗粒细胞的表型和功能的影响以及其对 ＴＧＦ－β通路下游相关基因及凋亡基因的表达调控， 为解析猪卵泡发育和排卵数量调控机理提供依据。大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞、无毒素质粒小提／ 大提试剂盒、普通琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 回收试剂盒、酵 母提取物、胰蛋白胨均购自天根生化科技（北京）有 限公司；限制性内切酶 ＮｏｔⅠ、ＢａｍＨⅠ和 ＥｃｏＲⅠ、 Ｔ４ＤＮＡ 连接酶和 ＲＮＡ 逆转录试剂盒均购自宝生 物工程（大连）有 限 公 司；总 ＲＮＡ 提取试剂盒购自 上海普洛麦格生物制品有限公司；氨苄青霉素购自 哈尔 滨 制 药 六 厂；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ 和 ＤＭＥＭ／ Ｆ１２均购 自 英 杰 生 命 技 术 有 限 公 司；青 霉 素 购 自 Ａｍｒｅｓｃｏ公司；ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ细胞凋亡检测 试剂盒购自 ＣＳＴ 公司。 超净工作台购自上海博迅医疗设备厂；超低温 冰箱（－８０ ℃）和台式 高 速 离 心 机 均 购 自 赛 默 飞 世 尔 科 技 公 司；ＣｙｃｌｅｒＴＭ ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＰＣＲ 仪、仪均购自Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司；ＤＮＰ－９０５２型电热恒温培养 箱和 ＤＫＢ－５－１Ａ 型超恒温水浴锅均购自上海精宏实 验设备有限公司；ＤＨＧ－９２４０ＡＳ型电热恒温鼓风干 燥箱购自宁波东南仪器有限公司；ＭＯ－２２７０ＭＩ（Ｎ） 微波炉购自青岛海尔制品有限公司。

    利用实时荧光定量 ＰＣＲ 方法 检 测 卵 泡 颗 粒 细 胞过表达和 干 扰 ＢＡＭＢＩ后，ＴＧＦ－β信 号 通 路 中 下 游基 因（ＴＧＦ－βＲⅠ、ＴＧＦ－βＲⅡ、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、 ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ５）和 细 胞 凋 亡 基 因（Ｂａｘ、 Ｂｃｌ－２）ｍＲＮＡ 的 表 达 水 平，以 ＧＡＰＤＨ 为 内 参 基 因。根据 ＮＣＢＩ公布的猪基因编码区，利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０设计实时荧光定量 ＰＣＲ 引物，送生工 生物工程（上海）股份有限公司合成，ＰＣＲ 反 应 体 系 ２５μＬ：ｃＤＮＡ 模 板 １μＬ， ＳＹＢ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ 染 料 １２．５ μＬ，上、下 游 引 物 （１０μｍｏｌ／Ｌ）各１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ９．５μＬ。实时荧光定 量 ＰＣＲ 反 应 程 序：９５ ℃ 预 变 性 ５ ｍｉｎ；９５ ℃ 变 性 １０ｓ，退火（具体温度见表２）２０ｓ，７２℃延伸１０ｓ，共 ４５个循环；７２℃延伸４ｍｉｎ；４℃保存。试验对所有 样本均进行３个重复测定，并在每次试验时用同体 积的无菌水作为阴性对照。