霉变黑毛茶真菌毒素残留检测-DK-500使用

黑茶初制生产工序历经杀青、揉捻、渥堆和干燥， 由此将茶树鲜叶制得黑毛茶，黑毛茶再通过筛分、轧切、风选、拼堆、蒸压、发花等精制工序加工成不同品 质风格的黑茶产品。中国茶叶流通协会报道了2018年全国黑茶产量为31.89万 t，占比六大茶类总量的12.20%， 位居六大茶类第2位。由于生产黑茶的鲜叶原料采摘通 常较为粗老，加工成的黑毛茶需在库房中存放1～2 a才能 进行精制，同时，售出的黑茶商品，消费者通常将其存 放一段时间以改善其粗涩的口感。在黑毛茶或成品黑茶 贮存过程中，如果遇到高湿高温的环境条件，特别是南 方的梅雨季节，茶叶表面则极易滋生霉菌，轻者有风 霉味，重者失去饮用价值，甚至产生安全问题。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

将来源于黑茶生产企业的黑毛茶（2016年5月产于湖 南省桃源县，一级，含水量（10.05±0.20）%）样品盛 于培养皿（培养皿开口，每份培养皿15 g茶样，分别置于 培养箱内5 层栅状隔板上，每层12 份，合计60 份），并 置于生化培养箱进行促霉培养。培养条件：温度25 ℃， 相对湿度90%。 人工促霉培养过程中分别按培养至第0、5、7、9、 11、13、15天依照栅状隔板分层取样混匀，－20 ℃密封 冻存。 从市场收集2 份自然霉变黑茶样品（霉变茯砖茶： ZM1，霉变花卷茶：ZM2）用于真菌毒素的对照分析。 咖啡碱标准品（99%）、可可碱标准品（95%）、 茶碱标准品（99%）、没食子酸标准品（90.34%）和 儿茶素标准品（DL-儿茶素（DL-catechin，DL-C）、 表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，EGC）、表儿茶素（epicatechin，EC）） 美国Sigma公司；70% ACCQ·TagTM洗脱液 美国 Waters公司；ML030104黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1， AFB1）酶联免疫试剂盒 上海酶联生物科技有限公司； ACCC30899黄曲霉菌株 中国农业微生物菌种保藏管理 中心；超纯水由Millipore纯水仪制备；乙腈、乙醇、甲 醇、冰醋酸、N,N-二甲基甲酰胺均为国产色谱纯，无水 乙醚为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GZ-150-HSII恒温恒湿箱 韶关市广智科技设备有 限公司；PB303-N电子天平 梅特勒-托利多仪器有限 公司；LDP-350型高速多功能粉碎机 浙江永康市红太 阳机电有限公司；上海精宏DK-500电热恒温水槽 上海精 宏实验设备有限公司；N13462C移液器 德国Eppendorf 公司；KQ3200B超声波清洗器 昆山超声仪器有限 公司；UV-2550紫外-可见分光光度计、LC-20AT高效液 相色谱仪 日本岛津公司；ACCQ·TagTM氨基酸分析 色谱柱（3.9 mm×150 mm，5 μm） 美国Waters公司； ECOSIL-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm） 广州绿 百草科学仪器有限公司；R-300旋转蒸发仪 瑞士Büchi 公司；1290-6460液相色谱-串联质谱仪 美国Agilent 公司；Aquelix 5超纯水制备仪 美国Millipore公司； 35R超速离心机 德国Rotina公司；3001型酶标仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 茶汤制备

准确称取粉碎茶样5.0 g于500 mL三角瓶中，加沸腾 蒸馏水450 mL，沸水浴浸提45 min，过滤，洗涤残渣， 滤液合并于500 mL容量瓶中，冷却后定容，摇匀，待 测。测定前待测样过0.45 μm滤膜，取滤液上机待测。

1.3.2 水分及多酚总量测定

水分含量测定参考GB 5009.3—2016《食品中水分的 测定》；茶多酚含量测定参考GB/T 8313—2008《茶叶 中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。

1.3.3 高效液相色谱分析

儿茶素组分、嘌呤碱、游离氨基酸含量及没食子酸 含量测参考刘建军等的方法。 儿茶素及嘌呤碱含量测定色谱条件：ECOSIL-C18色 谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；检测波长200 nm；进 样量10 μL；柱温40 ℃；流速1.0 mL/min；流动相A为超 纯水，流动相B为40% N,N-二甲基甲酰胺溶液溶液。梯度 洗脱程序：0.01 min，9% B；10 min，14% B；15 min， 23% B；27 min，36% B；31 min，36% B；32 min，9% B；37 min，停止。 ※安全检测 食品科学 2019, Vo

2 结果与分析


氨基酸是茶汤呈味物质的主要构成之一，口感主要 体现为鲜爽味，氨基酸含量的高低对茶汤鲜爽味的呈现 起着很大的作用。如表1所示，氨基酸总量随着霉变时间 的延长而逐渐降低，在霉变之初0～5 d降低最快，降低率 约为80.23%。茶氨酸为测定的18 种游离氨基酸组分中含 量最高的一类氨基酸，未霉变时约占游离氨基酸总量的 40.92%。在未霉变黑毛茶样本中，含量前5的氨基酸组分 为茶氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和蛋氨酸，霉变 第15天时排名前5的氨基酸组分为茶氨酸、天冬氨酸、谷 氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸。精氨酸和蛋氨酸含量在霉变 过程中降解速度很快，说明精氨酸较容易成为霉菌的氮 源而被霉菌所利用转化。在18 种氨基酸组分中仅酪氨酸 含量略有增加，未见因霉菌生化代谢转化而导致某类氨 基酸含量明显上升的现象。采用最小显著性差异法对茶 氨酸和18 种氨基酸总和在不同霉变时期的含量进行差异 显著性分析。结果表明：茶氨酸从霉变起始至霉变第5天 时含量变化呈显著性差异（P＜0.05）；18 种氨基酸总量 从霉变起始到霉变第7天时含量变化呈显著性差异，霉变 第9～15天含量变化呈现显著性差异。

3 讨 论

黑茶品质化学多集中于品质形成机理研究，但对于 高湿霉变环境引起的黑茶品质劣变的研究较少。本研究 从高湿条件下诱导黑毛茶的霉变过程着手，模拟梅雨季 节的贮藏条件，研究霉变黑毛茶的主要品质成分变化规 律及真菌毒素残留状况。 黑毛茶霉变过程中，氨基酸和儿茶素类物质在霉变 初期（第0～5天）含量下降迅速，其中茶氨酸作为18 种 游离氨基酸组分中含量最高的氨基酸，其含量的变化是 霉变过程黑毛茶氨基酸下降的主要原因，实验过程未检 测到因霉菌生化代谢转化而导致某类氨基酸含量明显上 升的现象。从霉变起始至霉变第5天，茶氨酸和18 种氨基 酸总量分别下降了71.65%和78.67%，至霉变第15天时， 其含量仅为起始含量的12.31%和13.95%。表明霉变过程 对黑茶品质带来了极大的影响。3 种嘌呤生物碱的总量 在霉变过程中基本保持稳定，茶碱在霉变过程中有所上 升，而咖啡碱则有所下降，两者存在数量相关性，其原 因可能在于部分霉菌存在嘌呤碱之间的转化能力。儿 茶素类组分主要以EGCG和EGC的含量降低为主，不含 没食子酸基团的儿茶素（EC、DL-C）和非表型儿茶素 （GCG）含量变化不大。这表明，霉菌存在水解儿茶素 没食子基团的能力，这在单体物质代谢研究中已经被证 明，但这种能力是否还受制于儿茶素的构型，有待 进一步实验证明。茶多酚和没食子酸含量在霉菌侵染的 过程中逐渐降低，表明该类物质能够被霉菌所代谢和转 化，具体的代谢转化机制及通路有待进一步研究。



 

免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。